骨科手术后有量大并发症，即感染和不充分的骨整合，并因此导致种植体松动、骨折畸形愈合或不愈合以及植入失败。感染通常是由于种植体表面细菌粘附和生物膜形成。由于能够抵抗宿主防御和抗生素，一个成熟的细菌生物膜可以使基于系统性抗生素的传统治疗方法无效。在严重的情况下，需要二次手术移去植入物。这不仅增加患者创伤也提高了费用。因此，有必要使人工植入材料具有有效的自我抗菌能力。目前多种方法被应用于此，包括抗菌结构、抗菌肽、银纳米颗粒等技术。然而，当抗菌剂加入以提高抗菌性的时候，骨诱导性往往降低而毒性上升。因此，关键是在抑制细菌的同时，允许足够的成骨细胞生长，也就是平衡细菌和成骨细胞之间的竞争。细胞和细菌的粘附可以通过不同结构的表面形貌来调节。由于成骨细胞的大小比细菌大一个数量级，成骨细胞和细菌对纳米棒阵列的敏感性有很大的差别。生物材料与适当的锌结合，可促进体外和体内的初始细胞粘附、铺展、增殖、成骨分化、骨形成和矿化。虽然纳米氧化锌具有良好的抗菌活性，但由于大量的Zn2+对细胞生长和组织形成产生不利影响，活性氧（ROS）可诱导细胞凋亡，因此具有明显的细胞毒作用。因此，控制锌离子的释放和纳米氧化锌的生成是平衡抗菌活性和细胞毒性的关键。聚多巴胺（PDA）具有良好的生物相容性、生物降解性、亲水性。此外，PDA具有较强的抗氧化作用，可清除反应性自由基。PDA与胺和/或含硫醇分子之间的反应有利于生物活性分子的接枝。类似的精氨酸甘氨酸-天冬氨酸（RGD）、RGD cysteine（RGDC）是提高许多类型的细胞附着到不同的基板，可以有效激活细胞整合素的粘附受体，因此，对肽共价结合是一个可行的策略来提高细胞的粘附和增殖的成骨性能的提高。

【成果简介】

近日，湖北大学、天津大学、香港城市大学以及香港大学的科研团队合作设计了氧化锌/聚多巴胺（PDA）/精氨酸甘氨酸天冬氨酸半胱氨酸-半胱氨酸（RGDC）纳米棒（NR）阵列并将其用于钛（Ti）植入物，不仅提高了骨诱导性同时还能有效杀死细菌。这都归因于在细菌与成骨细胞之间竞争中，ZnO/ PDA /RGDC纳米棒的选择性物理穿刺和生物功能化。由于成骨细胞的尺寸比细菌大得多，复合纳米棒可以穿刺细菌而不损伤成骨细胞。同时，通过抑制活性氧和高锌离子浓度，覆盖的PDA和RGDC提高了细胞相容性。体外实验证实了细菌膜的选择性穿刺和更好的成骨活性。体内试验也通过周围组织中更少的中性粒细胞分叶和细菌粘附显示出更高的抗菌效果。此外，即使在注射了细菌的情况下，复合纳米棒也加快了新骨组织形成（比纯钛高20.1%）以及植入物和与新形成组织的骨整合（比纯钛高32%）。相关成果以题为“Balancing Bacteria−Osteoblast Competition through Selective Physical Puncture and Biofunctionalization of ZnO/Polydopamine/ Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Cysteine Nanorods ”发表在了ACS Nano上。论文的通讯作者为吴水林教授。

【图文导读】

示意图1 通过ZnO/PDA/RGDC混合纳米棒阵列平衡种钛植体表面细菌-成骨细胞竞争的示意图

图1 材料的制备与表征1

(A)制备钛表面混合ZnO/PDA/RGDC纳米阵列的示意图；

FE-SEM图(B) Ti- ZnOs (比例尺=100 nm)，(C) Ti-ZnO, (D)Ti-ZnO/PDA, (E) Ti-ZnO/PDA/RGDC；

(E1) Ti-ZnO/PDA/ RGDC 横断面；

(E2) Ti-ZnO/PDA/ RGDC元素映射 (比例尺=100 nm(插入图=1 μm))

图2 材料的制备与表征2

(A) Ti, Ti-ZnOs, Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA和Ti-ZnO/PDA/RGDC的XRD分析；

(B) Ti-ZnO/PDA 和Ti- ZnO/PDA/RGDC的傅里叶分析；

(C) Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA, 和Ti-ZnO/PDA/RGDC的XPS分析；

(C1) Ti-ZnO/PDA峰 (C2) Ti-ZnO/PDA/RGDC峰;

(D) Ti, Ti-ZnOs, Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA, 和Ti-ZnO/PDA/RGDC上的水接触角及示意图。

误差条表示均值± 标准差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t检验)

图3 材料的制备与表征3

(A) Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA,和Ti-ZnO/PDA/RGDC的锌离子累积释放量；

(A1) 短期释放；

(B)对应A1的溶液pH值；PDA的降解

(C)紫外可见吸收光；

(D) 对应照片, (E) 对PDA化学降解途径（R组图S5）提出的化学公式；

(F) Ti, Ti-ZnOs, Ti-ZnO, Ti-ZnO/PDA和Ti-ZnO/PDA/RGDC的ESR谱；

(G) PDA和PDA/ZnO的1H HMR谱；

(H) Zn-PDA复合物的结构。

图4 材料的抗菌性测试1

(A) 多种表面经金葡菌和大肠杆菌处理后的荧光图像(比例尺 = 50 μm)；

(B) 大肠杆菌和金葡菌种于多种表面的FE- SEM图(比例尺 = 100 nm). 不同样本抗菌性：在琼脂板上再培养的细菌克隆菌落；

(C) 金葡菌和大肠杆菌在不同表面种植的浓度为 107 CFU/mL；

(D) 金葡菌和大肠杆菌从不同表面分离后再培养于琼脂糖；

(E) 对细菌细胞膜的通透性ONPG水解法测定；

(F)不同样品处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的蛋白质渗漏分析和(G)ATP水平；

误差条表示均值± 标准差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t检验)

图5 材料的抗菌性测试2

(A) 通过减少的百分比来表示的Ti-ZnOs/PDA/RGDC和Ti-ZnO/PDA/RGDC的抗菌性；

金葡菌和大肠杆菌从不同表面分离后再培养于琼脂糖；

(B)Ti-ZnOs/PDA/RGDC和Ti-ZnO/ PDA/RGDC的累积锌离子释放曲线；

(C) Ti, Ti-ZnOs/PDA/RGDC和Ti-ZnO/PDA/RGDC的ESR谱；

(D) 金葡菌和大肠杆菌处理于Ti, Ti-ZnOs/PDA/RGDC和Ti-ZnO/ PDA/RGDC TEM表面后的超薄切片电镜图像(约 70 nm) 和对应的EDS谱 (比例尺 = 500 nm). 误差条表示均值± 标准差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t检验)

图6 材料在体外的成骨性能测定

(A) 对培养与不同样本24小时的MC3T3-El细胞进行的F-actin染色(绿色) 和细胞核染色 (蓝色) (比例尺 = 50 μm)；

(B) 1，3，7天经MTT法对不同表面细胞存活率的测定；

(C) 1，3，7天对不同表面细胞碱性磷酸酶活性的测定；

(D)7天和14天的茜素红染色定量分析 ；

7天和14天不同样本成骨相关基因(E) ALP, (F) RUNX2和(G) OCN 的定量分析

误差条表示均值± 标准差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t检验)

图7 H&E染色(比例尺 = 50 μm) and Giemsa染色 (比例尺 = 5 μm) 图像显示术后2周和4周软组织和骨组织的感染情况

图8 材料在体内的成骨性能测定

(A) Micro-CT 显示术后四周兔股骨中Ti和Ti-ZnO/PDA/RGDC植入物周围新骨形成的2D和3D图像；

(B) 对骨重建的micro-CT 3D图像定量分析；

(C) VG染色显示的骨-植入物表面的组织学特征(比例尺 = 200 和 100 μm)；

(D) 通过组织学测定的新骨区域比例和骨-植入物接触The error bars indicate means ± standard deviations: *P < 0.05, **P < 0.05, and ***P < 0.001 (t test)

误差条表示均值± 标准差: *P < 0.05 and ***P < 0.001 (t检验)

【小结】

研究人员提出了一种全新的植入物表面复合材料氧化锌/聚多巴胺/精氨酸甘氨酸天冬氨酸半胱氨酸-半胱氨酸纳米棒，通过其选择性物理穿刺和生物功能化来平衡细菌-成骨细胞竞争，能够有效的抑制细菌同时降低毒性并提高成骨。这项工作提供了一种植入物表面的设计策略，使得种植体同时拥有理想的骨整合能力和抗感染能力。这将在骨科和口腔科中具有巨大的应用潜力。