白及为兰科植物白及的干燥块茎，具有收敛止血、消肿生肌之功效，主治肺胃出血、外伤出血、肺结核吐血、消化道溃疡、皮肤皲裂等。白及的药效成分主要含多糖、菲类、蒽醌类、联苄类等。其中白及多糖是白及块茎经水提醇沉得到的一种黏性多糖，其主要化学成分为葡萄甘露聚醣，有研究表明白及多糖外用对实质性器官、肌肉血管出血等有良好的止血作用，其止血作用机制是增强血小板第ⅲ因子活性、缩短凝血酶生成时间、抑制纤维蛋白酶的活性，同时促进细胞凝聚，形成人工血栓，从而达到止血之功效，同时白及多糖还具有一定的抑菌抗炎与促进伤口愈合的功效。白及多糖具有良好的生物降解性、安全、无毒副作用、无致热原性等特性，已作为一种安全可靠的生物医学材料应用于医药、化工行业。
3.气凝胶，又称干凝胶，是湿凝胶脱去大部分溶剂，使凝胶中液体含量远远小于固体含量，或凝胶的空间网状结构中充满的介质是气体，且结构保存完整的固体块状材料。其普遍特征是由相互贯通或封闭的孔洞构成的网络多孔结构，拥有较低的密度、极高的孔隙率、超高的比表面积和物质传输性，被广泛应用于众多领域。
4.将白及多糖氧化后，与磺胺嘧啶银反应，然后与聚乙烯醇混合交联制备含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶的技术方案在现有技术中并没有公开，本发明制备的银氧化白及
‑
pva复合气凝胶为三维多孔网络结构，具有良好的生物相容性、吸水保湿溶胀性能，该复合气凝胶抗菌效果、止血性好，对创面有促进愈合的作用；有望成为一种医用敷料。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
6.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤一、将磺胺嘧啶银溶解于氨水中，得到磺胺嘧啶银溶液；
8.步骤二、在氧化白及多糖水溶液中加入磺胺嘧啶银溶液，在35～40℃下振摇反应3～5h，然后加入聚乙烯醇水溶液，振摇混合18～24h，然后离心，上清液超声脱气后加入到模具中，
‑
22～
‑
18℃预冻10～14h，然后真空冷冻干燥，得到含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶。
9.优选的是，所述步骤一中，氨水采用质量分数为37％的氨水；磺胺嘧啶银溶液的浓度为3～6％(w/v)；所述步骤二中，氧化白及多糖水溶液的浓度为3～6％(w/v)，其配制方法为：将氧化白及多糖溶解于去离子水中；所述步骤二中，聚乙烯醇水溶液的浓度为3～6％(w/v)。
10.优选的是，所述氧化白及多糖的制备方法为：将白及多糖溶解在去离子水中，得到
浓度为1～3％(w/v)的白及多糖水溶液，然后加入naio4，室温避光下以200～400r/min搅拌反应18～26h，然后加入与naio4等物质的量的乙二醇，继续搅拌1～3h终止反应，离心，上清液经截流量为3kda的透析袋于蒸馏水中透析48h后进行真空冷冻干燥，并直到透析液加硝酸银检测无沉淀生成，得到氧化白及多糖。
11.优选的是，所述naio4与白及多糖结构单元的摩尔比为0.2:1。
12.优选的是，所述白及多糖的制备方法为：将8～12质量份白及块茎粉末加入300～500体积份去离子水中，煎煮法提取1～2h，4000～6000rpm离心8～15分钟，沉淀物重复提取两次；收集上清液，用旋转蒸发器在70～85℃真空下浓缩至80～150体积份，将浓缩液缓慢倒入2～4倍体积的无水乙醇中，在4℃下醇沉过夜，离心收集沉淀物，真空冷冻干燥，得到白及多糖。
13.优选的是，所述步骤二中，磺胺嘧啶银溶液、氧化白及多糖水溶液和聚乙烯醇水溶液的体积比为0.25:0～4.5:0.5～5；其中，氧化白及多糖与聚乙烯醇的质量比为1～9:1～9。
14.本发明还提供一种如上述的含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶的抗菌用途，所述的抗菌用途是抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长繁殖。
15.本发明还提供一种如上述的含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶在血液相容性中的应用。
16.本发明还提供一种如上述的含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶用于止血敷料的用途。
17.本发明还提供一种如上述的含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶在创面愈合中的用途。
18.本发明至少包括以下有益效果：本发明的气凝胶是从白及中提取得到白及多糖，将白及多糖氧化后，与磺胺嘧啶银反应后，与聚乙烯醇混合交联而成，所得银氧化白及
‑
pva复合气凝胶为三维多孔网络结构，具有良好的生物相容性、吸水保湿溶胀性能，该复合气凝胶抗菌效果、止血性好，对创面有促进愈合的作用；有望成为一种医用敷料。
19.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明：
20.图1为本发明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶红外谱图；
21.图2为本发明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶sem图；a
‑
f依次为pva、agsd
‑
orbp/pva9、agsd
‑
orbp/pva7、agsd
‑
orbp/pva5、agsd
‑
orbp/pva3、agsd
‑
orbp/pva1；
22.图3为本发明银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶保水性曲线图；
23.图4为本发明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶的抑菌圈照片；
24.图5为本发明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶血液相容性能图；
25.图6为本发明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶凝血指数图；
26.图7为本发明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶肝脏止血能力图；
27.图8为本发明伤口再生皮肤组织学分析，标尺为500μm。(白色虚线：表皮与真皮分界线，白色箭头：毛细血管，黑色箭头：毛囊)
28.图9为本发明血清中tnf
‑
α和vegf
‑
a的浓度。
具体实施方式：
29.下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
30.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
31.实施例1：
32.一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶的制备方法，包括以下步骤：
33.步骤一、将10g白及块茎粉末加入400ml去离子水中，煎煮法提取1h，5000rpm离心10分钟，沉淀物重复提取两次；收集上清液，用旋转蒸发器在80℃真空下浓缩至100ml，将浓缩液缓慢倒入3倍体积的无水乙醇中，在4℃下醇沉过夜(12h)，离心收集沉淀物，真空冷冻干燥，得到白及多糖(rbp)；
34.步骤二、将白及多糖溶解在去离子水中，得到浓度为2％(w/v)的白及多糖水溶液，然后加入naio4，室温避光下以300r/min搅拌反应24h，然后加入与naio4等物质的量的乙二醇，继续搅拌2h终止反应，离心，上清液经截流量为3kda的透析袋于蒸馏水中透析48h后进行真空冷冻干燥，并直到透析液加硝酸银检测无沉淀生成，得到氧化白及多糖(orbp)；所述naio4与白及多糖结构单元的摩尔比为0.2:1；
35.步骤三、将磺胺嘧啶银溶解于氨水(质量分数为37％)中，得到4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液；
36.步骤四、在0.5ml浓度为4％(w/v)的氧化白及多糖水溶液中加入0.25ml浓度为4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液，在37℃下振摇反应4h，然后加入4.5ml浓度为4％(w/v)的聚乙烯醇水溶液，振摇混合20h，然后离心，上清液超声脱气后加入到模具中，
‑
20℃预冻12h，然后真空冷冻干燥，得到含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶(agsd
‑
orbp/pva9)。
37.实施例2：
38.一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶的制备方法，包括以下步骤：
39.步骤一、将10g白及块茎粉末加入400ml去离子水中，煎煮法提取1h，5000rpm离心10分钟，沉淀物重复提取两次；收集上清液，用旋转蒸发器在80℃真空下浓缩至100ml，将浓缩液缓慢倒入3倍体积的无水乙醇中，在4℃下醇沉过夜(12h)，离心收集沉淀物，真空冷冻干燥，得到白及多糖；
40.步骤二、将白及多糖溶解在去离子水中，得到浓度为2％(w/v)的白及多糖水溶液，然后加入naio4，室温避光下以300r/min搅拌反应24h，然后加入与naio4等物质的量的乙二醇，继续搅拌2h终止反应，离心，上清液经截流量为3kda的透析袋于蒸馏水中透析48h后进行真空冷冻干燥，并直到透析液加硝酸银检测无沉淀生成，得到氧化白及多糖；所述naio4与白及多糖结构单元的摩尔比为0.2:1；
41.步骤三、将磺胺嘧啶银溶解于氨水(质量分数为37％)中，得到4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液；
42.步骤四、在1.5ml浓度为4％(w/v)的氧化白及多糖水溶液中加入0.25ml浓度为4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液，在37℃下振摇反应4h，然后加入3.5ml浓度为4％(w/v)的聚乙烯醇水溶液，振摇混合20h，然后离心，上清液超声脱气后加入到模具中，
‑
20℃预冻12h，然后真空冷冻干燥，得到含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶(agsd
‑
orbp/pva7)。
43.实施例3：
44.一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶的制备方法，包括以下步骤：
45.步骤一、将10g白及块茎粉末加入400ml去离子水中，煎煮法提取1h，5000rpm离心10分钟，沉淀物重复提取两次；收集上清液，用旋转蒸发器在80℃真空下浓缩至100ml，将浓缩液缓慢倒入3倍体积的无水乙醇中，在4℃下醇沉过夜(12h)，离心收集沉淀物，真空冷冻干燥，得到白及多糖；
46.步骤二、将白及多糖溶解在去离子水中，得到浓度为2％(w/v)的白及多糖水溶液，然后加入naio4，室温避光下以300r/min搅拌反应24h，然后加入与naio4等物质的量的乙二醇，继续搅拌2h终止反应，离心，上清液经截流量为3kda的透析袋于蒸馏水中透析48h后进行真空冷冻干燥，并直到透析液加硝酸银检测无沉淀生成，得到氧化白及多糖；所述naio4与白及多糖结构单元的摩尔比为0.2:1；
47.步骤三、将磺胺嘧啶银溶解于氨水(质量分数为37％)中，得到4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液；
48.步骤四、在2.5ml浓度为4％(w/v)的氧化白及多糖水溶液中加入0.25ml浓度为4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液，在37℃下振摇反应4h，然后加入2.5ml浓度为4％(w/v)的聚乙烯醇水溶液，振摇混合20h，然后离心，上清液超声脱气后加入到模具中，
‑
20℃预冻12h，然后真空冷冻干燥，得到含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶(agsd
‑
orbp/pva5)。
49.实施例4：
50.一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶的制备方法，包括以下步骤：
51.步骤一、将10g白及块茎粉末加入400ml去离子水中，煎煮法提取1h，5000rpm离心10分钟，沉淀物重复提取两次；收集上清液，用旋转蒸发器在80℃真空下浓缩至100ml，将浓缩液缓慢倒入3倍体积的无水乙醇中，在4℃下醇沉过夜(12h)，离心收集沉淀物，真空冷冻干燥，得到白及多糖；
52.步骤二、将白及多糖溶解在去离子水中，得到浓度为2％(w/v)的白及多糖水溶液，然后加入naio4，室温避光下以300r/min搅拌反应24h，然后加入与naio4等物质的量的乙二醇，继续搅拌2h终止反应，离心，上清液经截流量为3kda的透析袋于蒸馏水中透析48h后进行真空冷冻干燥，并直到透析液加硝酸银检测无沉淀生成，得到氧化白及多糖；所述naio4与白及多糖结构单元的摩尔比为0.2:1；
53.步骤三、将磺胺嘧啶银溶解于氨水(质量分数为37％)中，得到4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液；
54.步骤四、在3.5ml浓度为4％(w/v)的氧化白及多糖水溶液中加入0.25ml浓度为4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液，在37℃下振摇反应4h，然后加入1.5ml浓度为4％(w/v)的聚乙烯醇水溶液，振摇混合20h，然后离心，上清液超声脱气后加入到模具中，
‑
20℃预冻12h，然后真空冷冻干燥，得到含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶(agsd
‑
orbp/pva3)。
55.实施例5：
56.一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶的制备方法，包括以下步骤：
57.步骤一、将10g白及块茎粉末加入400ml去离子水中，煎煮法提取1h，5000rpm离心10分钟，沉淀物重复提取两次；收集上清液，用旋转蒸发器在80℃真空下浓缩至100ml，将浓缩液缓慢倒入3倍体积的无水乙醇中，在4℃下醇沉过夜(12h)，离心收集沉淀物，真空冷冻
干燥，得到白及多糖；
58.步骤二、将白及多糖溶解在去离子水中，得到浓度为2％(w/v)的白及多糖水溶液，然后加入naio4，室温避光下以300r/min搅拌反应24h，然后加入与naio4等物质的量的乙二醇，继续搅拌2h终止反应，离心，上清液经截流量为3kda的透析袋于蒸馏水中透析48h后进行真空冷冻干燥，并直到透析液加硝酸银检测无沉淀生成，得到氧化白及多糖；所述naio4与白及多糖结构单元的摩尔比为0.2:1；
59.步骤三、将磺胺嘧啶银溶解于氨水(质量分数为37％)中，得到4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液；
60.步骤四、在4.5ml浓度为4％(w/v)的氧化白及多糖水溶液中加入0.25ml浓度为4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液，在37℃下振摇反应4h，然后加入0.5ml浓度为4％(w/v)的聚乙烯醇水溶液，振摇混合20h，然后离心，上清液超声脱气后加入到模具中，
‑
20℃预冻12h，然后真空冷冻干燥，得到含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶(agsd
‑
orbp/pva1)。
61.对比例1：
62.一种agsd/pva复合气凝胶的制备方法，包括以下步骤：
63.步骤一、将磺胺嘧啶银溶解于氨水(质量分数为37％)中，得到4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液；
64.步骤四、在0.25ml浓度为4％(w/v)磺胺嘧啶银溶液中加入5ml浓度为4％(w/v)的聚乙烯醇水溶液，振摇混合20h，上清液超声脱气后加入到模具中，
‑
20℃预冻12h，然后真空冷冻干燥，得到agsd/pva复合气凝胶(agsd/pva)。
65.对比例2：
66.将5ml浓度为4％(w/v)的聚乙烯醇水溶液，振摇20h，超声脱气后加入到模具中，
‑
20℃预冻12h，然后真空冷冻干燥，得到纯pva气凝胶(pva)。
67.图1为本发明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶的红外谱图；
68.分析方法：将样品粉末采用溴化钾圆盘压片法制样，在nicolet 6700 ft
‑
ir光谱仪(thermo scientific instrument)上进行扫描获得红外图谱，扫描范围400
‑
4000cm
‑1，分辨率4cm
‑1；
69.在agsd的红外谱图中，3394cm
‑1、3343cm
‑1和3261cm
‑1处为n
‑
h伸缩振动峰，1353cm
‑1和1135cm
‑1处为
‑
so2对称伸缩振动峰。在rbp中，1060cm
‑1和1151cm
‑1处吸收峰代表糖苷键c
‑
o
‑
c的不对称伸缩振动，1733cm
‑1处吸收峰属于乙酰基中c＝o的拉伸振动。同rbp相比，由于醛基和乙酰基中c＝o的叠加，orbp的红外谱图在1733cm
‑1处显示出更强的吸收峰，说明氧化改性成功。在复合气凝胶红外谱图中，1655cm
‑1处出现小肩部新峰，这归因于酰胺的拉伸，以及1733cm
‑1处吸收峰的消失，证明了agsd和orbp之间发生席夫碱反应，交联成功。此外，在946cm
‑1处显示pva独特且不同于orbp的吸收峰，这说明pva已成功添加到含银氧化白及复合气凝胶中。
70.图2为本发明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶的sem图；
71.分析方法：将气凝胶借助双面碳带将海绵固定在试样架上，并在真空中使用离子溅射系统(sc7620,emitech,great britain)用金溅射180s。然后用扫描电子显微镜(evo 18,zeiss,germany)检查海绵的形貌特征；
72.图2a
‑
f依次为pva、agsd
‑
orbp/pva9、agsd
‑
orbp/pva7、agsd
‑
orbp/pva5、agsd
‑
orbp/pva3、agsd
‑
orbp/pva1；所有气凝胶均具有三维网孔结构，随orbp和pva比例的不同，形貌结构发生了变化。纯pva气凝胶(图2a)显示出片层状结构相互重叠，不规则开放网孔的特点。一定量orbp加入后，网孔逐渐闭合形成蜂窝网孔结构，且孔间壁由密集的微孔组成，为气凝胶吸水和保水能力提供了条件。当orbp含量高于70％后，复合气凝胶又恢复到开放的网孔，以条带状相互连接的支撑网孔。
73.表2为本发明气凝胶孔隙率测试结果；
74.测试方法：采用溶剂置换法测定气凝胶的孔隙率。具体方法如下：取气凝胶样品称定其重量，记录为m1(g)，游标卡尺测定其直径和高度，计算体积(cm
‑3)；将已知重量和体积的样品置无水乙醇中浸泡24h后，取出供试品，吸去表面多余的乙醇，称定其重量，记录为m2(g)。样品一式三份。按下面公式计算孔隙率(p,porosity)：p＝(m2‑
m1)/ρv式中：ρ为乙醇密度(g.cm
‑3)。
75.从表1可以看出，同纯pva气凝胶孔隙率相比，复合气凝胶孔隙率提高了20％以上，这对气凝胶在作为医用敷料应用中良好的透气性奠定了基础。
76.表1
77.气凝胶孔隙率(％)pva72.41
±
0.61agsd
‑
orbp/pva985.66
±
0.80agsd
‑
orbp/pva790.51
±
1.20agsd
‑
orbp/pva590.20
±
0.99agsd
‑
orbp/pva390.41
±
0.67agsd
‑
orbp/pva186.61
±
2.09
78.图3为本发明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶保水性；
79.测试方法：各组样品浸入到37℃的pbs缓冲液中，达到溶胀平衡的凝胶样品去除表面多余的水分，称重记录ws。将溶胀凝胶样品置于37℃的烘箱中，并在特定的时间取出称重记录wi。按下面公式计算孔隙率：保水率(water
‑
retention ratio)＝wi/ws
×
100％。
80.在适当范围内，提高复合气凝胶中orbp含量(0
‑
50％)，对于气凝胶保水性能无明显的影响，8h以内达到失水平衡。当复合气凝胶中orbp含量进一步提高时，保水能力下降明显，如orbp含量为70％和90％时，几乎分别在3h和2h以内达到失水平衡。
81.实施例6：
82.一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶的抗菌用途，所述的抗菌用途是抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长繁殖；
83.抑菌试验方法：
84.菌种选择：大肠杆菌(e.coli,atcc 25922)和金黄色葡萄球菌(s.aureus,atcc 6538)
85.lb固体培养基配方：酵母膏5g，胰蛋白胨10g，nacl 10g，琼脂15～20g，水1000ml，121℃灭菌20min。按培养基配方准确称取酵母膏、胰蛋白胨、nacl和琼脂粉(20g)倒入烧杯中，加1000ml蒸馏水，磁力搅拌加热溶解，使用1mol/l naoh或1mol/l hcl调ph至7.0
‑
7.2(精密ph试纸测试即可)，分装到三角烧瓶(小于1/2体积)，加塞、包扎，0.1mpa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。
86.灭菌后，在超净工作台中冷却至50℃左右，倒平板(150mm培养皿，30ml左右培养基)，待培养基凝固后，加入200ul菌液(约106
‑
107cfu/ml)于培养基上，用涂布器涂布均匀，放上灭菌的气凝胶(提前用紫外灭菌120min)，于37℃下培养24h，取出测量抑菌圈的大小。
87.图4为含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶的抑菌圈照片；表2为气凝胶抑制区直径统计结果(mm)；
88.表2
89.气凝胶e.coils.aureuspva10.00
±
0.1310.00
±
0.09agsd/pva14.77
±
0.2016.19
±
0.40agsd
‑
orbp/pva917.71
±
0.2519.99
±
0.02agsd
‑
orbp/pva718.94
±
0.0721.18
±
0.52agsd
‑
orbp/pva519.46
±
0.2121.30
±
0.10agsd
‑
orbp/pva323.16
±
0.7022.44
±
0.23agsd
‑
orbp/pva124.32
±
0.2423.99
±
0.65
90.含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制区统计结果如表2所示。纯pva气凝胶组抑制区直径与气凝胶直径相近，说明该气凝胶无抑菌活性。当agsd添加到pva气凝胶中，由于agsd具有一定的抑菌活性，所以agsd/pva气凝胶组表现出对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌一定的抑制区直径。所有含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶组都显示出显著高于纯pva气凝胶组和agsd/pva气凝胶组的抑制区直径，这说明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶组具有更佳的抗菌活性。这种优异的抗菌活性有望在伤口护理过程中控制炎症和避免伤口感染。
91.实施例7：
92.一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶在血液相容性中的应用；
93.血液相容性测试：
94.溶血率测试方法：通过离心(1000转/分
×
10分钟)大鼠新鲜全血除去血清获得纯红细胞，并用pbs洗涤五次。然后用pbs溶液稀释纯红细胞，得到浓度为2％(v/v)的红细胞悬浮液。将海绵(4mg)浸入5ml红细胞悬浮液中，并在37℃下以100rpm振荡速度孵育1小时。然后，将样品离心后(3000rpm
×
5min)用紫外
‑
可见分光光度计(uv)于540nm处测量上清液的吸光度。将4毫升红细胞悬液在1毫升pbs中用作阴性对照，而将4毫升红细胞悬液在1毫升去离子水中用作阳性对照。溶血率使用以下公式计算：
95.溶血率(％)＝(at
‑
an)/(ap
‑
an)式中：at气凝胶组溶血后吸光度，ap阳性对照组溶血吸光度，an阴性对照组溶血吸光度。
96.图5为含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶血液相容性能；溶血率测试结果见图5：所有气凝胶组的溶血率显著低于阳性对照组，说明气凝胶具有良好的血液相容性。尽管含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶组的溶血率显示均高于纯pva气凝胶，这可能是银离子的引入造成的，但均在2％左右，这被认为是无血液毒性的。
97.实施例8：
98.一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶用于止血敷料的用途；
99.止血性能
100.全血凝固试验：用心脏采血法采集大鼠新鲜血液，置于抗凝管中。将海绵样品放入24孔板中，并在37℃预热30分钟。将抗凝血全血(200μl)和0.2mol/l氯化钙(20μl)分配到气凝胶上，然后在37℃下以40转/分的速度摇动平板10分钟。用5ml去离子水冲洗血凝块，使未固定在血凝块中的红细胞溶血。用微孔板在540nm处读取血红蛋白溶液的吸光度。凝血指数(bci)使用以下公式计算:
101.凝血指数(bci)＝as/ac式中as表示气凝胶处理后未被捕获在血块中红细胞溶血后血红蛋白吸光度，ac表示200μl抗凝全血在5ml去离子水中溶血后血红蛋白吸光度。
102.肝脏止血试验：雄性昆明种小鼠(30
‑
40g，中国成都达硕)分为7组(n＝3)，麻醉后固定于手术台上。通过打开腹腔暴露小鼠的肝脏，并小心地吸入肝脏周围多余的液体。预先称重的滤纸放在肝脏下以吸收血液。手术刀造成肝脏急性出血伤口，立即用气凝胶覆盖出血部位表面。未治疗的急性伤口作为对照组。最后用称重法量化各组的失血量。
103.凝血指数和肝失血量分别见图6和图7；图6含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶凝血指数；含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶凝血指数均显著低于纯pva气凝胶。随orbp含量变化，复合气凝胶的凝血指数呈先降低再上升的趋势，这可能与含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶凝微观结构变化有关。agsd
‑
orbp/pva5气凝胶组的凝血指数最低，表明该组气凝胶最强的血液凝结能力。
104.图7为含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶肝脏止血能力；同对照组相比，含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶组失血量均显著降低，而纯pva气凝胶组与对照组失血量无显著性差异，说明含银氧化白及多糖
‑
pva复合气凝胶具有一定的止血能力。其中agsd
‑
orbp/pva5气凝胶治疗组小鼠肝脏失血量仅为对照组的23％左右，表现出最佳的止血能力。这在伤口形成时，可以降低或避免大量失血带来的不良影响，具有作为止血敷料的潜力。
105.实施例9：
106.一种含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶在创面愈合中的用途；
107.创面愈合性能研究：
108.1.小鼠全层皮肤缺损模型建立及治疗：
109.用于评估复合气凝胶促进伤口愈合的能力。实验在昆明小鼠中进行，体重为18
‑
22g。所有动物均按照国家研究委员会的实验动物护理和使用指南进行治疗和护理。
110.首先，将所有动物随机分为4组(n＝12)，每组有雌性和雄性小鼠各一半。这四组分别是对照组(纳米银敷料)、纯pva气凝胶、orbp/pva5气凝胶和agsd
‑
orbp/pva5复合气凝胶。所有小鼠在手术前适应1周。手术前用75％乙醇对小鼠进行消毒，并用8％na2s去除毛发并观察1天。所有手术都是在无菌条件下进行的。通过腹膜内注射水合氯醛(0.3g/kg)麻醉小鼠，并剪去尾部和背部之间的皮肤，构造全层皮肤缺损模型(直径约1cm)。接下来，用不同的敷料覆盖伤口，并用透气纱布固定。为了追踪伤口愈合轨迹和统计伤口愈合率，用数码相机对每组小鼠在第3、7、10、14天的伤口拍照，然后用image j软件量化伤口收缩面积。术后第3、5、10、14天摘除小鼠眼球采集血液样品。在3000转/分钟离心15分钟后，收集血清并在
‑
80℃下储存。最后，根据制造商的说明，通过酶联免疫试剂盒(中国南京建成)测定血清中tnf
‑
α和vegf
‑
a的含量。
111.2.伤口愈合率：
112.伤口愈合率(％)使用以下公式计算:
113.伤口愈合率(％)＝(s0‑
s
n
)/s0
×
100％，式中s0表示初始伤口面积，s
n
表示不同处理n天后伤口面积(n＝3、7、10或14)。
114.不同敷料处理伤口愈合率结果见表3：
115.表3
[0116][0117]
通过对各组小鼠平均愈合率的统计可以看出，纯pva气凝胶组在整个愈合过程中均与纳米银敷料组(对照组)相近的愈合率。而orbp/pva5复合气凝胶组在治疗3天后伤口愈合率显著高于对照组，在治疗7天、10天和14天后与对照组都无显著性差异，这表明添加单一的orbp对于促进伤口愈合的能力有限。对于agsd
‑
orbp/pva5复合气凝胶组(含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶组)，在整个伤口愈合过程中都处于领先水平，伤口愈合率均显著高于其余组，这说明该复合气凝胶具有良好的促进伤口愈合的潜力。
[0118]
3.伤口愈合的组织学分析
[0119]
苏木精
‑
伊红染色评估再生皮肤重建的速度和质量。具体而言，在5、10、14天收集伤口区域的再生皮肤组织，用4％多聚甲醛固定，然后包埋在石蜡中并切片至5um厚，最后用苏木精
‑
伊红染色。所有切片都用显微镜(ba300，motic)进行观察和拍照记录。
[0120]
典型照片见下图8；图8为伤口再生皮肤组织学分析，标尺为500μm。(白色虚线：表皮与真皮分界线，，白色箭头：毛细血管，黑色箭头：毛囊)
[0121]
在炎症的中后期(第5天)，纯pva组大量炎性细胞的浸润，说明炎症反应严重。在orbp/pva和agsd
‑
orbp/pva复合气凝胶组中少量炎性细胞和完整上皮层的形成，表明复合敷料对于炎症可以减弱炎症，加速上皮化的进程。治疗第10天后，各组均已形成完整上皮，特别的是，agsd
‑
orbp/pva5气凝胶组比纳米银敷料组(对照组)和纯pva气凝胶组出现了更多的皮肤功能器件(如血管和毛囊)，这表明含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶更有利于功能性皮肤的重建。治疗第14天后，agsd
‑
orbp/pva5气凝胶组中结缔组织高度的规则性、真皮与皮下组织的紧密连接，展现了最佳的伤口修复效果。
[0122]
4.tnf
‑
α和vegf
‑
a的表达
[0123]
图9为血清中tnf
‑
α和vegf
‑
a的浓度；通过测定治疗小鼠血清中肿瘤坏死因子
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α(tnf
‑
α)和血管内皮生长因子
‑
a(vegf
‑
a)的浓度来评估其表达，从而揭示含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶促进伤口愈合的生物学机制。从图9中可以看出，纳米银敷料组(对照组)、orbp/pva气凝胶组和agsd
‑
orbp/pva5气凝胶组治疗的小鼠血清中tnf
‑
α的浓度低于纯pva气凝胶治疗组。而对于vegf
‑
a，orbp/pva和agsd
‑
orbp/pva5气凝胶治疗组的小鼠血清中的浓度高于对照组和纯pva气凝胶组。这表明含银氧化白及
‑
pva复合气凝胶敷料可以通过下
调tnf
‑
α的表达，降低伤口感染的风险，以及上调vegf
‑
a的表达，促进血管生成和促进伤口的再上皮化，从而促进伤口的愈合和完美组织的修复。
[0124]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。