本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种气凝胶的制备方法及其应用。

背景技术：

肌钙蛋白是近几年才发展起来的一种新的诊断心肌缺血、坏死的高敏感、高特异且诊断窗口期长的心肌损伤标志。其对心肌细胞损伤的敏感性、特异性均优于肌酸激酶(ck)及肌酸激酶同工酶(ck-mb)，目前已作为冠心病急性冠脉综合征的诊断、病情评估和预后判断的重要指标。由于组织特异性高，心肌肌钙蛋白t(ctnt)是心肌损伤的特异性和高敏感性的标志物。心肌肌钙蛋白t在心肌梗死后约3-4小时释放并持续2周左右。相比st段抬高型心肌梗死(stemi)，心肌肌钙蛋白对非st段抬高型心肌梗死(nstemi)的诊断更有价值。根据心肌梗死的新定义，当血中心肌肌钙蛋白的水平高于标准值(正常人群)的第99百分位点值，并有心肌缺血的表现(症状、ecg的改变或影像学结果)时，则可诊断为心肌梗死。这就要求肌钙蛋白的检测方法在99百分位点的不精密性(变异系数)小于等于10％。心肌肌钙蛋白t(ctnt)是能预测急性冠状动脉综合症短期、中期甚至长期结局的一种独立的预后诊断标志物。

现有技术中制备的气凝胶有的是透明度很低，有的不能够亲水层析，有的不能够通过大粒径的荧光微球，都不适合做免疫侧向层析的材料。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述缺陷，本发明的主要目的在于提供一种气凝胶的制备方法及其应用，制备得到的气凝胶能够吸附抗体、通过大粒径的荧光标记微球以及能够进行亲水层析，而且透光率高，可用作层析材料。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种气凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将硝酸纤维素溶解，得到纤维素溶胶；

2)以质量百分数计，将80-90％的无水乙醇、3％的正硅酸乙酯、1％的氨水、5％的二甲基环硅氧烷以及1-11％的水混合溶解，得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液；

3)将二氧化硅气凝胶预聚体混合液与酸混合，搅拌均匀；

4)将经步骤3)处理后的二氧化硅气凝胶预聚体混合液与所述纤维素溶胶按2:5-1:10的重量份数比例混合，得到反应物，并加入交联剂进行交联，搅拌后，真空干燥得到硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶。

作为进一步的优选，所述步骤1)中，采用溶剂溶解所述硝酸纤维素，所述溶剂选自丙酮、乙醚乙醇混合液以及含有二甲基亚砜的甲醇。

作为进一步的优选，所述含有二甲基亚砜的甲醇中，二甲基亚砜的质量百分比占5-8％。

作为进一步的优选，所述步骤2)中，将90％的无水乙醇、3％的正硅酸乙酯、1％的氨水、5％的二甲基环硅氧烷以及1％的水混合溶解，得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液。

作为进一步的优选，所述步骤3)中，所述酸选自浓度为0.1-1m的硫酸或盐酸。

作为进一步的优选，所述步骤4)中，所述交联剂的浓度为1-5％。

作为进一步的优选，所述交联剂选自3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷及戊二醛。

作为进一步的优选，所述步骤4)中还包括：所述搅拌后，将所述交联后反应物中的溶剂置换成1-5％浓度的乙醇。

一种气凝胶的的应用，所述气凝胶用于荧光免疫层析中检测肌钙蛋白t。

本发明的有益效果是：本发明将硝酸纤维素溶解，得到纤维素溶胶，制备得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液，并通过与酸混合将其催化，正硅酸乙酯水解变成二氧化硅；然后将二氧化硅气凝胶预聚体混合液与所述纤维素溶胶按2:5-1:10的重量分数比例混合，进行交联，充分搅拌后，最终得到硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶。本发明方法可制备出高透明，合适孔径，及具有抗体蛋白吸附能力的亲水性气凝胶，使用该气凝胶制备层析试纸条，并用于分离样品，并使用纳米级含螯合铕的时间分辨荧光微球作为标记微球，检测限达到了pg/ml级别，适用于超敏肌钙蛋白t侧向层析检测。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的气凝胶作为试纸条的层析材料的结构示意图。

附图中标记说明如下：1-pvc板，2-样品垫，3-标记线，4-检测线，5-质控线，6-气凝胶膜，7-吸水纸

具体实施方式

本发明通过提供一种气凝胶的制备方法及其应用，解决了现有气凝胶不适合做免疫侧向层析的材料的缺陷。

而在肌钙蛋白t等的免疫层析检测中，需要一种能够吸附抗体，能够通过大粒径的荧光标记微球，能够进行亲水层析，而且透光率很高的材料来作为层析材料，这种材料符合上述的所有的特性，才能够适合检测肌钙蛋白t的poct高灵敏度分析。

为了解决上述问题，本发明实施例的主要思路是：

本发明实施例的气凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将硝酸纤维素溶解，得到纤维素溶胶；

2)以质量百分数计，将80-90％的无水乙醇、3％的正硅酸乙酯、1％的氨水、5％的二甲基环硅氧烷以及1-11％的水混合溶解，得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液；

3)将二氧化硅气凝胶预聚体混合液与酸混合，搅拌均匀；

4)将经步骤3)处理后的二氧化硅气凝胶预聚体混合液与所述纤维素溶胶按2:5-1:10的重量份数比例混合，得到反应物，并加入交联剂进行交联，搅拌后，真空干燥得到硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶。

本实施例步骤1)中为了得到纤维素溶胶，可采用能够溶解硝酸纤维素的溶剂，例如：丙酮、乙醚乙醇混合液以及含有二甲基亚砜的甲醇等。

本实施例步骤2)中，按各原料的质量百分比，称取各原料并混合溶解，以得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液，上述各质量百分比的选取，有助于在与纤维素凝胶混合后最终形成透明的气凝胶。各原料可选用市售产品。

本实施例步骤3)中，将二氧化硅气凝胶预聚体混合液与酸混合，将二氧化硅气凝胶预聚体混合液与酸混合，起催化作用；其中的酸可选用例如稀硫酸或盐酸。

本实施例步骤4)中，将经步骤3)处理后的二氧化硅气凝胶预聚体混合液与所述纤维素溶胶按一定的重量分数比例混合，并交联得到硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶，该气凝胶具有合适的孔径和比较好的蛋白吸附能力，吸附是通过混合硝化纤维的成分来实现的，合适的原料浓度控制孔径的大小。交联时，可加入1-5％质量百分浓度的交联剂，用于交联二氧化硅和纤维素。

另外，在搅拌后，可将交联后反应物中的溶剂置换成1-5％浓度的乙醇，降低酒精浓度，便于冻干成型，上述置换可采用常规的透析操作，上述真空干燥可采用冻干机冻干操作。

为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特举数实施例，来说明本发明所述之气凝胶的制备方法及其应用。

实施例1

本发明实施例硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶的制备方法，包括如下步骤：将硝酸纤维素使用含8％二甲基亚砜(dmso)的甲醇溶解，得到纤维素溶胶，上述硝酸纤维素(硝化纤维)货号为80037760，来自国药集团化学试剂有限公司；按质量百分比计算，称量占90％的无水乙醇，3％的正硅酸乙酯，1％的氨水，5％的二甲基环硅氧烷以及1％的水，混合溶解，得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液；将上述二氧化硅气凝胶预聚体混合液加入1m的稀硫酸后搅拌均匀，然后与纤维素溶胶进行2:5的重量份数比例混合，得到反应物，并加入1％浓度的双功能交联剂3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行交联，充分搅拌后，将反应物中的溶剂置换成5％浓度的乙醇，使用冻干方式得到硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶。

实施例2

本发明实施例硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶的制备方法，包括如下步骤：将硝酸纤维素使用丙酮溶解，得到纤维素溶胶，上述硝酸纤维素(硝化纤维)货号为80037760，来自国药集团化学试剂有限公司；按质量百分比计算，称量占80％的无水乙醇，3％的正硅酸乙酯，1％的氨水，5％的二甲基环硅氧烷以及11％的水，混合溶解，得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液；将上述二氧化硅气凝胶预聚体混合液加入1m的稀硫酸后搅拌均匀(上述二氧化硅气凝胶预聚体混合液与稀硫酸的重量份数比为100:1)，然后与纤维素溶胶进行2:5的重量份数比例混合，得到反应物，并加入1％浓度的双功能交联剂戊二醛进行交联，充分搅拌后，将反应物中的溶剂置换成3％浓度的乙醇，使用冻干方式得到硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶。

实施例3

本发明实施例硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶的制备方法，包括如下步骤：将硝酸纤维素使用含5％二甲基亚砜(dmso)的甲醇溶解，得到纤维素溶胶，上述硝酸纤维素(硝化纤维)货号为80037760，来自国药集团化学试剂有限公司；按质量百分比计算，称量占85％的无水乙醇，3％的正硅酸乙酯，1％的氨水，5％的二甲基环硅氧烷以及6％的水，混合溶解，得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液；将上述二氧化硅气凝胶预聚体混合液加入0.1m的稀硫酸后搅拌均匀，然后与纤维素溶胶进行1:10的重量份数比例混合，得到反应物，并加入5％浓度的双功能交联剂3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行交联，充分搅拌后，将反应物中的溶剂置换成1％浓度的乙醇，使用冻干方式得到硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶。

实施例4

本发明实施例硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶的制备方法，包括如下步骤：将硝酸纤维素使用乙醚乙醇混合液溶解，得到纤维素溶胶，上述硝酸纤维素(硝化纤维)货号为80037760，来自国药集团化学试剂有限公司；按质量百分比计算，称量占86％的无水乙醇，3％的正硅酸乙酯，1％的氨水，5％的二甲基环硅氧烷以及5％的水，混合溶解，得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液；将上述二氧化硅气凝胶预聚体混合液加入0.5m的盐酸后搅拌均匀(上述二氧化硅气凝胶预聚体混合液与盐酸的重量份数比为100:1)，然后与纤维素溶胶进行1:5的重量份数比例混合，得到反应物，并加入3％浓度的双功能交联剂戊二醛进行交联，充分搅拌后，使用冻干方式得到硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶。

将实施例1制备得到的硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶应用于荧光免疫层析中作为试纸条的层析材料，来检测肌钙蛋白t，并采用如下试验来验证本发明实施例气凝胶的效果，具体试验例如下：

试验例一：荧光免疫层析试纸条的制备

采用双抗体夹心法反应模式，以羧基荧光微球标记的抗人肌钙蛋白t单克隆抗体及羊抗兔igg为标记抗体，用喷膜机喷一定浓度的标记抗体、人肌钙蛋白t和兔igg于硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶膜上分别作为标记线、检测线(t线)和质控线(c线)。试纸条的组装是在聚氯乙烯(pvc)板上顺次相互搭接样品垫、气凝胶膜和吸水纸，然后用切条机切割成4mm宽的试纸条，试纸条组成如图1所示。测试时将75μl待测血清样本直接加入加样孔中，反应3min后用荧光定量检测仪检测。荧光微球的标记过程参照现有技术的方法。时间分辨荧光微球购自南京微测生物科技有限公司。粒径为：56nm或者92nm。每毫升1％荧光微球分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2mg的抗体对检测线荧光信号t值的影响，以确定最佳抗体标记浓度，通过实验：此最佳抗体标记浓度为1.0mg/ml。以标记线荧光微球使用浓度30％+3％，t、c线蛋白浓度2.0mg/ml喷膜，制备试纸条。

试验例二：试纸条检测性能评价

1.检测限以零浓度将抗人血清作为标本重复测定20次，计算其荧光信号均值(x)及标准差(sd)，将+2sd所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出其检测限。使用罗氏定标液浓度分别为18pg/ml和4200pg/ml配制标准液：浓度分别为18pg/ml，350pg/ml，700pg/ml，2100pg/ml和4200pg/ml。得到标准曲线，回归方程y＝0.00993x+0.00324(决定系数r＝0.99974、p<0.01)，荧光信号c/t值与罗氏肌钙蛋白t标准品浓度在0-2.1ng/ml范围内具有良好的线性关系。将x±sd所得的荧光值代入标准曲线方程计算得出其检测限为4pg/ml，试剂分析灵敏度较高。

2.精密度抽取两个批次的ctnt-hs检测试剂，分别对ctnt-hs浓度18pg/ml和4200pg/ml标准品进行检测，每个浓度重复测定20次，计算批内和批间各浓度变异系数(coefficientofvariation，cv)。结果如下：批内和批间变异系数分别为3.1％-6.3％和6.7％-10.3％，批内与批间各检测浓度cv<12％，试剂精密度较高。

3.回收率在已知5个不同浓度的ctnt-hs血清中加入不同浓度的ctnt-hs纯抗原，使得血清中ctnt-hs的期望浓度为50ng/l和100ng/l，每个浓度重复测试5次，计算回收率，即实测值与理论值的比值。荧光免疫层析检测试剂在回收率在93.6％-108.3％之间，平均回收率为102.3％，表明添加物与血清被测物一致，基本没有血清基质物的干扰。

4.临床验证用本试剂盒检测244例临床血清样本，以罗氏-ctnt-hs试剂检测结果为对照，每个临床样本测试2次取平均值，比较其检测结果的相关性和一致性。罗氏-ctnt-hs试剂盒测定的数值进行相关性分析，结果两种方法所测试值有显著相关性，线性回归方程y＝0.9911x+1.9132，pearson相关性系数r＝0.995，p<0.01。因此可以认为两种方法测量的结果具有较好的一致性。

上述本申请实施例中的技术方案，至少具有如下的技术效果或优点：

本发明将硝酸纤维素溶解，得到纤维素溶胶，制备得到二氧化硅气凝胶预聚体混合液，并通过与酸混合将其催化，正硅酸乙酯水解变成二氧化硅；然后将二氧化硅气凝胶预聚体混合液与所述纤维素溶胶按2:5-1:10的重量分数比例混合，进行交联，充分搅拌后，最终得到硝酸纤维素/二氧化硅气凝胶。本发明方法可制备出高透明，合适孔径，及具有抗体蛋白吸附能力的亲水性气凝胶，使用该气凝胶制备层析试纸条，并用于分离样品，并使用纳米级含螯合铕的时间分辨荧光微球作为标记微球，检测限达到了pg/ml级别，适用于超敏肌钙蛋白t侧向层析检测。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。