【引言】

过去几十年来，随着蛋白质组学和蛋白质工程等新兴领域的发展，蛋白药物在数量和种类上都在不断增长。蛋白质药物具有活性高、特异性强和毒性低的优点，可以有效治疗许多疾病，如肝炎、糖尿病和癌症。然而，稳定性差、生物利用度低、生物膜通透性差和免疫原性等缺点大大限制了蛋白质药物的开发。纳米载体（包括脂质体和聚合物纳米粒子）的应用，为提高蛋白药物的稳定性、生物利用度以及降低免疫原性提供了一种有效的策略。纳米凝胶具有高容水量，可调节的物理化学性质和良好的生物相容性。其纳米尺寸（100-200 nm）适用于血液中的长循环，并可优先靶向目标作用部位，如肿瘤组织。这些特性使纳米凝胶成为蛋白质递送应用和纳米医学用于癌症治疗的有利候选者。

【成果简介】

近日，中国药科大学莫然教授（通讯作者）等人报道了肿瘤特异性自降解纳米凝胶用于用于静脉给药蛋白药物的高效递送。该纳米凝胶以合成的胆固醇和丙烯酰胺双修饰透明质酸衍生物（cm-HA）为载体材料，利用胆固醇疏水作用力物理交联，结合光引发丙烯酰胺化学交联，协同组装形成纳米凝胶（cNG）。该纳米凝胶对不同分子量和等电点的蛋白均有高负载效率，并具有高稳定性。为了增强纳米凝胶的肿瘤组织渗透性，并达到肿瘤细胞内蛋白药物的可控释放及载体完成递送任务后的及时降解的目标，在纳米凝胶中引入了酸激活的透明质酸酶（aHAase），构建了肿瘤微环境响应性自降解纳米凝胶（D/aH-cNG）。在肿瘤微环境中，弱酸激活部分aHAase，引起cNG涨大并释放活化的HAase。释放HAase可以降解肿瘤细胞外基质的主要成分HA，从而促进 cNG在肿瘤基质中的扩散。被肿瘤细胞摄取进入酸性内吞囊泡后，aHAase被完全激活。活性HAase完全降解cNG，释放包载的蛋白脱氧核糖核酸酶I（DNase I），后者会降解DNA引起肿瘤细胞死亡，从而发挥肿瘤效力。该成果以“Tumor-Specific Self-Degradable Nanogels as Potential Carriers for Systemic Delivery of Anticancer Proteins”为题于2018年2月19日发表在期刊Advanced Functional Materials上。

【图文导读】

图1. 肿瘤特异性自降解D/aH-cNG用于静脉给药蛋白药物的高效递送的示意图

a）协同交联的D/aH-cNG的组装和肿瘤特异性自降解的示意图；

b）D/aH-cNG对提高抗肿瘤蛋白药物递送能力的示意图。（i）D/aH-cNG在肿瘤组织部位蓄积; （ii）肿瘤弱酸性微环境部分激活aHAase，其导致D/aH-cNG的涨大和活性HAase的细胞外释放，释放的HAase降解HA组成ECM以增强纳米凝胶在基质中的扩散；（iii）D / aH-cNG渗透到深部肿瘤区域；（iv）D/aH-cNG被肿瘤细胞内吞;（v）内吞小泡中的酸性环境完全激活HAase，导致cNG的完全降解和细胞内DNase I的快速释放；（vi）释放的DNase I降解DNA引起肿瘤细胞死亡。

图2. 稳定性考察

a）由不同胆固醇己二胺与HA羧基（Chol：COOH）投料比合成得cm-HA自组装得到的pNG的粒径和多分散系数（PDI）；

b）与HP-β-CD共孵的cNG和pNG随时间的粒径变化；

c）Rho-D-pNG与HP-β-CD共孵前后的Rho-D释放曲线；

d）Rho-D-pNG和Rho-D-cNG与FBS共孵后的Rho-D释放曲线。

图3. 纳米凝胶的表征

a）D/aH-cNG的粒径分布直方图和TEM图像（比例尺：100 nm）；

b）在不同pH值下，D/aH-cNG随时间的大小变化；

c）在不同pH值下，Rho-D/aH-cNG中Rho-D的释放曲线；

d）在不同pH值下，用D/aH-cNG和D-cNG与DNA底物共孵，吸光度在260nm处随时间的变化曲线。

图4. 细胞摄取、胞内转运与释放

a)A549细胞在用HA预处理后与Rho-D/aH-cNG共孵1小时后的共聚焦显微镜图像（Alexa Fluor 488染细胞膜）；

b)A549细胞在不同情况下与Rho-D/aH-cNG共孵1小时后的相对荧光强度（RFI）；

c)A549细胞与Rho-D/aH-cNG共孵0.5小时和4小时后的共聚焦显微镜图像（Lyso Tracker Green染溶酶体，Hoechst染细胞核）；

d)A549细胞与Rho-D/FITC-D/aH-cNG共孵1小时和6小时后的共聚焦显微镜图像(Hoeshst染细胞核)。黄色箭头指出了Rho-D与FITC-D重叠的点。红色箭头和绿色箭头分别指出了Rho-D和FITC-D（比例尺为10 µm）。

图5. 组织分布和肿瘤渗透性

a）荷瘤小鼠经静脉注射Cy5.5-D/aH-cNG（i）和游离Cy5.5-D（ii）后3小时和24小时的图像。红色箭头指向为肿瘤区域；

b）静脉注射24小时后从小鼠上收集的不同组织的图像。从1到6分别为心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏和肿瘤；

c）通过ROI分析不同组织的平均荧光强度。从1到6分别为心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏和肿瘤；

d）荷瘤小鼠经静脉注射Rho-D/aH-cNG和Rho-D-cNG后24小时的肿瘤组织的共聚焦显微镜图像（比例尺为100 µm）。

图6. 体内外抗肿瘤活性评价

a）用不同制剂处理后的A549细胞的活力;

b）用D-aH/cNG处理后通过TUNEL测定法染色的A549细胞的荧光图像（比例尺为20 µm）；

c）用不同制剂处理后，荷瘤小鼠的肿瘤大小变化，* p <0.05；

d）不同制剂首次给药30天后的肿瘤重量， * p <0.05，** p <0.01；

e）不同制剂首次给药30天后，用H＆E染色的肿瘤图像（比例尺为100 µm）；

f）不同制剂首次给药30天后，用Ki-67抗体染色的肿瘤图像（比例尺为100 µm）。

【小结】

总之，该研究设计了一种肿瘤特异性酸响应的自降解纳米凝胶，用于高效的蛋白质输送和癌症治疗。基于HA的协同交联的纳米凝胶具有内部水合网络结构，对于不同分子量（MW）和等电点（pI）的蛋白质均具有高负载能力，而且具有良好的血浆稳定性。纳米凝胶中引入酸活化的aHAase，可实现有效的级联蛋白递送：肿瘤组织的深层渗透、细胞摄取的增加、细胞内蛋白质的可控释放和载体材料的有效降解。这一策略将促进具有程序性自驱动降解性的纳米载体的开发，为蛋白药物的递送和肿瘤治疗提供新技术和新手段。