荧光显微镜在分子生物学研究和细胞内环境监测方面都有很重要的应用。而一些成像技术，比如扫描电镜、扫描隧道显微镜和原子力显微镜等，虽然能满足微观尺度的成像，但由于其对样品不可逆的破坏和只能针对表面成像的缺点，限制了其在生物体成像中的应用。与此相比，荧光显微镜对生物活体的高度相容性，使其可以监测生物体内的一些动态过程。随着对生物微观领域探索的发展，对荧光显微镜提出了更高的要求。传统的荧光显微镜由于衍射极限的存在，无法对生物体微观世界进行成像。通过科学家的不懈努力，超分辨成像技术应运而生，实现了衍射极限以内的高分辨率成像。

1.光学衍射极限

点光源通过光学系统成像，由于光的衍射特性，所成的像并不是点，而是有一定半径的斑，即艾里斑。因此，当两个点光源的间距缩小到一定程度时，两个光斑就会叠在一起，使得成像的分辨率降低。这个间距就是光学衍射极限。Ernst Abbe用数学公式推导和表达了光学衍射极限

通常通用物镜的NA最大值为1.49，因而可以推算出对于可见光，其分辨率大概为200纳米。因此可以认为200纳米为传统光学显微镜的分辨率极限，200纳米以内的微观结构都无法观察。

要达到光学衍射极限，需要满足两个条件。首先要求物体与像平面的距离要远大于光的波长；其次点光源要同时发光，这样衍射光斑才可以叠加在一起。因此，只要光学探针距离物体的距离远小于光波长，或者点光源在不同时间分别发光，就可以打破衍射极限，实现超分辨成像。

2.超分辨成像技术

常规所用到的超分辨成像技术主要分为两类。一类是基于荧光单分子的精确定位。比如由庄小威、Eric Betzig等人所发明的荧光活化定位显微技术（fPALM）、光活化定位显微技术（PALM）和随机光学重建显微技术（STORM）。这些方法都是利用荧光单分子随机的发光，通过多拍摄几次的方法，将这些荧光单分子的激发结果相叠加形成整个图像；第二类是将衍射斑变小，比如受激发射损耗荧光显微技术（STED）。STED系统需要两束光，一束为激发光，另一束为损耗光。激发光使衍射斑以内的荧光分子从基态跃迁到激发态，而损耗光则使部分处于衍射斑外围的电子通过受激发射的方式回到基态。处于光斑中心的电子不受影响，继续以荧光的方式回到基态，因此有效地减少了衍射光斑的面积，实现了衍射极限以内的成像。

3.用于超分辨成像的荧光探针

由于超分辨荧光成像的在生物学研究中的迅速发展，针对超分辨成像荧光探针的研究与开发也受到了广泛的关注。这里，主要介绍以下几类荧光探针在超分辨成像中的应用。

（1）基于二芳烯和螺吡喃生色团的光学开关材料

二芳烯作为一种常见的光致变色材料在数据储存和光转换方面都有广泛的用途。通过将苝单酰亚胺和二芳烯共价连接，可以克服二芳烯荧光量子产率较低的缺点。所形成的荧光探针同时具备了光转换性质和较高的荧光量子产率。当二芳烯关环时，苝单酰亚胺的发射光谱和二芳烯的吸收光谱重叠，荧光共振能量转移使苝单酰亚胺的荧光被二芳烯猝灭；当二芳烯开环时，二芳烯的吸收光谱移动，两者之间的荧光共振能量转移消失，苝单酰亚胺发光。这个光致变色的分子成功地用在了PALM成像中，分辨率高达100纳米，实现了对嵌段聚合物的微观结构的成像。

螺吡喃作为一种光致变色材料，染料本身是无色的，在紫外光照射后开环形成两性离子部花菁结构。后者在500-650纳米具有显著的吸收，发光范围在红光到近红外区间。由于螺吡喃的光学开关性质，成功用于PALM成像，并实现了对嵌段共聚物微观结构的观察。

基于二芳烯的光学开关材料

基于螺吡喃的光学开关材料

（2）不可逆的光激活荧光探针

除了光学开关材料，光激活探针也能用在超分辨成像中。光激活探针是指一类荧光染料从无荧光发射转换到荧光发射状态后，不能再回到初始状态的分子。

香港科技大学的唐本忠院士课题组报导了一种光激活的荧光探针，o-TPE-ON+，可针对细胞线粒体进行特异性成像。o-TPE-ON+本身由于分子量很强的ICT作用不发光，在光照下发生周环反应，转换成很亮的c-TPE-ON+。此探针实现了对活细胞线粒体的STORM成像，分辨率达到了纳米级别。

不可逆的光激活荧光探针

（3）量子点

量子点是一种纳米级别的半导体，通过对其施加一定的电场或者光压，电子点会发出特定频率的光。吉林大学吴长锋课题组将两种具有较高荧光强度的聚合物PFBT和CN-PPV，通过优化纳米再沉淀法制备了分布均一的聚合物量子点。特异性地对活细胞内的亚细胞结构进行标记，实现了活细胞的SOFI成像。

量子点在活细胞超分辨成像中的应用

（4）荧光蛋白

用于超分辨成像的荧光蛋白被分为三类。第一类是不可逆的光激活荧光蛋白，这类荧光蛋白的荧光可以通过特定波长的光激发，激发后不能恢复到激发前不发光的状态；第二类是光转移荧光蛋白，这类荧光蛋白的激发光谱和发射光谱可以通过光照来移动改变；第三类是光学开关荧光蛋白，这类荧光蛋白的荧光可以通过光照来实现“开和关”状态的切换。

Eos蛋白的不可以光转移

Dronpa蛋白的可逆荧光开关

荧光超分辨成像技术为人类探索微观领域提供了有效地途径和方法。随着科技的发展，相信越来越多性能更优越的荧光材料会被开发出来，届时，微观领域的研究成果会更加炫目。