尽管铁蛋白的载药方法有很多种，但根据载药过程中铁蛋白的行为可分为三类：第一类是让药物通过铁蛋白的通道，主动包载到笼状结构内，这种方法的整个制备过程不改变铁蛋白形态；第二类是先将铁蛋白笼状结构解聚，充分与药物孵育后再让铁蛋白的笼状结构重组；第三类是介于前两者之间，用变性剂扩宽铁蛋白的通道，再利用主动载药将药物包载在笼状结构内。

图4 铁蛋白载药方式示意图

1.     物理孵育法

因铁蛋白纳米笼状结构具有8个亲水通道和6个疏水通道，这为金属离子及其他小分子药物进入笼状结构中提供了有效途径，因此可直接将铁蛋白与将要包载的药物分子进行混合孵育，利用铁蛋白的空腔对药物进行包载。但对于分子量较大的药物，包载效率会大大降低。

铜离子可用于物理孵育铁蛋白包载阿霉素。先将铜离子和阿霉素孵育形成复合物，该复合物能顺利通过铁蛋白的亲水通道，使铁蛋白的笼状结构完成对药物的包载。疏水性药物则可利用疏水通道完成药物包载，例如吉非替尼、酪氨酸激酶抑制剂等。

孵育法也适用于基因工程构建的共递送亲-疏水药物的铁蛋白药物载体。将疏水肽-亲水肽-RGD肽功能性基序替换人重链铁蛋白（Humanheavy chain ferritin，HFn）亚基的第五螺旋，使多肽功能基序在铁蛋白外表面。通过铁蛋白的亲水性药物通道和笼外表面上展示的疏水性肽，孵育一定时间，将亲水药物表阿霉素和疏水药喜树碱分别装载到铁蛋白笼状结构的内腔和外表面。

该方法的缺点除了不能包载大分子药物外，因其包载机制的限制，载药量和包封率皆不高，还有很大的改善空间。

图5 双靶向铁蛋白及其抗肿瘤作用机理示意图

2.    pH 介导的解聚/重组法

物理孵育法是通过铁蛋白结构中疏水通道和亲水通道进行药物包载，但对于分子量较大的药物，因其通道狭小无法使药物分子进入空腔结构内，pH介导的解聚/重组法则可用于大分子药物的包载，其基本原理是利用酸碱度变化使铁蛋白笼状结构完成一次解聚和重组，在这个过程实现对药物的包载。

铁蛋白能在很宽的pH范围内保持笼状结构的稳定，但是当大幅度反复改变铁蛋白溶液pH值时，可使铁蛋白笼状结构的亚基发生解聚与重组的互相转化。在极度酸性或碱性条件下, 蛋白亚基发生解聚, 而当溶液 pH 值恢复到中性时, 解聚的亚基又可以重新自组装恢复成笼状结构，并对药物进行包载。和其他方法相比，这种pH值依赖的解聚/重组特性, 更利于其对药物的包载。

图6 pH介导的解聚/重组法示意图

pH介导的解聚/重组法用于包载米托蒽醌的过程中，将铁蛋白溶液pH值先后调节到2.5实现笼状结构的解聚，与药物溶液混合培养后，再将铁蛋白溶液pH值调至7.5实现笼状结构的重组，并将小分子药物米托蒽醌包载入铁蛋白纳米笼状结构中。

图7 pH介导的解聚/重组法包载米托蒽醌示意图

pH介导的解聚/重组法用于包载顺铂的过程与包载米托蒽醌一样，将铁蛋白溶液和顺铂溶液混合后，先将pH值调至2.2使铁蛋白笼状结构解聚，室温下培养后将pH值调回7.5，室温下搅拌1小时，铁蛋白笼状结构重组，并将顺铂包载其中。对混合溶液超滤洗涤，去除未包载的游离顺铂。包封在铁蛋白内的顺铂储存在− 20℃条件下。

该方法需要摸索合适的pH，因为不同类型的铁蛋白解聚和重组所需的pH值不同，例如普通的铁蛋白需要在pH值低于2或者高于11时才能解聚，而变型后的铁蛋白，则需要在pH值低于4时才能解聚。该方法的缺点则是太极端的pH环境可能会永久性破坏铁蛋白，引起药物包载能力和稳定性的下降，并且工艺转化也存在一定难度，不适用于酸碱敏感药物。

3.    尿素梯度法

铁蛋白在低浓度变性剂中稳定存在，而在高浓度变性剂作用下发生变性。尿素梯度法是指将铁蛋白与尿素溶液混合, 通过铁蛋白先变性后复性的过程实现对药物的包载。即首先将铁蛋白与高浓度尿素溶液混合而使其完全解聚成亚基, 之后将需包载的药物加入其中, 并将尿素溶液浓度递减, 逐渐完成铁蛋白笼状结构的复性并完成对药物的包载。

根据尿素浓度的不同，包载方式存在一定的差异。当尿素浓度过高时，铁蛋白的笼状结构完全解聚，此时是利用铁蛋白结构重组包载药物；当尿素的浓度控制在一定范围内时，铁蛋白的笼状结构并未完全解聚，此时是通过尿素溶液扩宽笼状结构的通道，让更多或分子量更大的药物进入笼状结构内。此法虽然载药量较高，但效率却较低。

利用天然H-铁蛋白（HFn）包载阿霉素时，将铁蛋白混合于高浓度尿素中，旋转一段时间至完全解聚，将阿霉素加入其中。培养一定时间，用含阿霉素的尿素缓冲液梯度透析（尿素浓度逐渐减小），再去除游离阿霉素，即用铁蛋白笼状结构包载阿霉素。