纳米晶的制备方法可分为三类：Top-Down，Bottom-up，Top-Down和Bottom-up结合。

图3 纳米晶制备技术的分类

1. Top-Down

Top-Down技术通常叫“自上而下”技术，即从药物本身直接微粉化处理成产品，但更为合适的叫法应该是分散法（Dispersion Technique），指通过机械力使大的药物颗粒减小至纳米级颗粒的方法，主要包括介质研磨法、高压均质法等。

图4 分散法

（1）介质研磨法

介质研磨法（PearlMilling Technique）是纳米晶的第一代制备技术，由Liversidge公司于1990年开发，技术平台被称为Nanocrystals。介质研磨法分为干法研磨和湿法研磨两种，工业上主要采用湿法介质研磨（WetMedia Milling，WMM）。

研磨室内研磨介质的粒径在0.1~20nm范围内，通常是以陶瓷（钇稳定氧化锆）、氧化锆、不锈钢、玻璃、铬、玛瑙、玻璃或聚苯乙烯树脂为涂层的珠子。药物、稳定剂和水按照一定比例混合后，投入到装有研磨介质的封闭研磨腔体内，高速转动下使药物粒子、研磨介质和器壁相互碰撞，产生持续且强烈的撞击力和剪切力提供药物颗粒微粉化所需的能量，从而制得纳米晶。

制备时的研磨时间根据所需的粒子粒度而定，与药物的硬度、批量、研磨珠的数量、研磨转速、研磨温度等密切相关，研磨时间与研磨转速成反比，通常选用低速长时间研磨或者高速短时间研磨。但过高的研磨转速、过大的批量、过长的研磨时间是导致小粒子聚集成大粒子的主要原因，并且时间越长，微生物负荷就越难控制。

研磨珠的数量、尺寸和研磨的温度影响纳米晶的粒度分布。增加研磨珠数量会增加药物粒子碰撞的概率，但同时又会因表面电荷的存在使粒子聚集。研磨珠的粒径越小彼此间的空隙就越小，因此粒径越小的研磨珠制备的纳米晶粒径就更小。研磨室的温度影响药物粒子的稳定性，通常来说低温能减缓药物粒子之间的聚集，对研磨室进行降温或者加入液氮，能使纳米晶的粒径更小且粒度分布更窄。

图5 湿法研磨技术原理图

（2）高压均质法

高压均质法（High Pressure Homogenisation，HPH）是纳米晶的第二代制备技术，由Muller等人在20世纪90年代开发，主要分为微射流技术和活塞-狭缝均质技术。微射流技术是通过喷射气流，使药物混悬液快速通过均质室，在管道内反复改变方向，形成空穴效应、撞击效应和剪切效应，减小药物微粒粒径。活塞-裂隙均质技术是将经微粉化预处理的难溶性药物制成混悬液粗品，粗品在高压匀质机高压泵的作用下高速通过匀化阀狭缝，通过控制高压均质循环数次来精准控制产品粒径。

均质技术最早采用的介质是非水溶剂或者水溶剂和非水溶剂的混合溶剂（水/丙二醇），早在2000年就发展起来，适用于易水解药物，该技术被称为Nanopure技术。根据粗品处理技术的不同，可分为两种技术：微流体技术对粗品混悬液进行均质化处理的技术被称为IDD-P^TM(InsolubleDrug Delivery Particles)技术，活塞-狭缝对粗品混悬液进行均质化处理的技术被称为Dissocubes技术。

图6 微流体技术均质示意图

图7 活塞-狭缝均质示意图

高压均质的压力越大，流体在狭缝处的流速就越大，产生能量以均质破坏粒子，所制备的纳米晶体粒径就越小。但是，并非所有的药物都能在高压力下实现粒子的破裂，有的药物需要增加均质次数来对微粒进行反复均质，所以均质压力和均质次数要根据药物的硬度和性质来设置。但均质次数越多，粒子分布范围越窄。均质过程中因为摩擦力的存在会导致均质温度升高，热敏药物存在降解的可能，但现在的均质机或者微射流设备已能实现根据需求全程控温。

微射流反应技术(Microfluidicreaction technology，MRT)与高压均质法类似，药液在高压腔内混合经喷嘴的微孔形成高速流体喷入反应腔，在反应腔内对流剪切形成湍流，同时存在空化效应、撞击效应和剪切效应，减小产品粒径。

表1 介质研磨法和高压均质法的优缺点对比

（3）激光烧蚀和破碎技术

激光烧蚀和破碎技术（Laserablation and crushing technology）是近年发展来用于制备纳米晶的新技术。采用激光烧蚀技术时，药物在激光作用下由固体中喷射而出，在周围的液体中形成纳米晶药物；采用激光破碎技术时，激光直接破碎药物微粒的粗混悬液，形成纳米晶体药物。

飞秒激光烧蚀和破碎技术的原理是使药物固体在短时间内能量快速累积，在转化为热量之前产生冲击波，促进药物颗粒破碎。而纳秒激光烧蚀和破碎技术的原理是能量在固体药物中以热的形式积聚起来，加热后的化合物升华成单个分子，在水溶液中重新结晶，形成纳米沉淀物。

激光烧蚀和破碎技术属于新型技术，需要更多的实践经验去证明其广泛的应用价值。该方法最显著的优点是对活性成分直接处理，无需使用有机溶剂，其缺点是冲击波或者热量容易引起部分敏感药物的氧化降解和晶型的改变。

2. Bottom-up

Bottom-up技术亦称为“沉淀法”（PrecipitationTechnique），基本原理是从药物的过饱和溶液中沉淀出药物纳米晶体，可细分为溶剂-反溶剂沉淀法、超临界流体法、溶剂蒸发和喷雾干燥法等。

图8 沉淀法

（1）溶剂-反溶剂沉淀法

溶剂-反溶剂沉淀法（solvent-antisolvent precipitation）是将药物溶液（溶解于与水互溶的有机溶剂）和反溶剂（通常为水或者水性介质）充分混合，形成水相过饱和溶液，使药物成核并形成沉淀，最终形成纳米级药物晶体。

最早应用于工业化生产的溶剂-反溶剂沉淀法是Novartis的Hydrosols技术和Soliqs的NanoMorph技术，两种技术的差异在于药物晶体存在的形式不同。Hydrosols技术是最早利用沉淀原理制备纳米晶体的水溶胶方法，被称为“via humida paratum（VHP）”，其过程便是将药物溶解在溶剂中，再加入到非溶剂中形成分散的药物纳米晶体。而NanoMorph技术是用于制备无定型纳米晶体的方法，将药物溶解于能与水混溶的溶剂中，再沉淀在含聚合物的水溶液中形成纳米晶，溶液中的聚合物能限制晶体的生长和聚集。优点是无定形纳米晶体比晶体形式有更高的饱和溶解度和更快的溶出速率，缺点是收率较低，废料无法再利用。

影响溶剂-反溶剂沉淀法的因素很多，包括两相溶剂混合和药物沉淀时间、药物浓度、有机相与水相的比例、表面活性剂的浓度和位置(水相或有机相)、搅拌的速度和强度、有机溶液的注入速度。药物溶液的浓度越高，溶液的黏液就越高，在水相中的过饱和度就越高，增加颗粒聚合的机会，形成的晶核就越多，最终形成晶体的粒径就越小。而温度也影响着纳米晶体的粒径，温度越高形成的颗粒粒径越小，因为低温溶液中药物的过饱和度低，晶体成核速率和生长速度较快。

控制晶体的生长是精准控制药物颗粒粒径的最佳方法，很多物理方法被用于控制晶体生长，如高重力控制沉淀法(Highgravity controlled precipitation, HGCP)、液体撞击射流沉淀和多入口涡流混合器沉淀法、冷冻干燥控制沉淀法、喷雾干燥控制沉淀法、酸碱反应产生CO₂辅助沉淀法、微射流反应技术(Microfluidic reaction technology，MRT)沉淀法、超声辅助沉淀法等等。通过控制每种方法的物理参数，实现对晶体生长的控制。

比如超声波辅助沉淀法是利用超声波诱导，超声处理增加药物微混合，提高晶体成核速率并减少晶体的的生长和结块，控制的超声参数有超声强度、超声时间、探头长度、探头在溶液中的位置等实现对粒径的控制。

而酸碱反应产生CO₂辅助沉淀法是利用酸碱中和反应产生CO₂，利用气体的泡腾作用控制晶体的形成。该方法采用有机溶剂和有机酸溶解难溶性药物，除去溶剂后得到酸相，在酸相中加速碳酸盐水溶液，酸碱中和反应快速生成CO₂，产生的气泡发挥微观混合作用，实现对纳米晶体的控制。为更好地抑制晶体团聚，往往会加入稳定剂吸附药物疏水表面。

沉淀法的缺点是有机溶剂的使用，最终产品的溶剂残留存在较大的安全问题，并且沉淀后的晶体再分散性、规模放大效应和样品稳定性均存在一定难度。

（2）超临界流体法

超临界流体法（Supercriticalfluid technology）是将药物溶解于超临界流体(Supercritical fluid，SCF)中，当超临界液体通过孔径较小的喷嘴减压雾化时，超临界流体迅速气化使药物结晶，形成药物纳米晶。CO₂是最常用的流体，因为CO₂的临界温度为31℃，最低临界压力为73.8bar，易于转化为超临界状态，并且成本低安全性高，不易燃烧且易于除去。

超临界流体法包括超临界流体快速膨胀法(Rapidexpansion of supercritical solution， RESS)，超临界快速膨胀溶液接收法（Rapidexpansion of a supercritical solution into a liquid solvent，RESOLV）和超临界反溶剂法（Supercritical antisolvent，SAS）。

在超临界流体快速膨胀法(RESS)中，药物溶解于超临界流体中，药液通过喷嘴时减压会改变密度使药物过饱和而成核形成晶体。超临界快速膨胀溶液接收法（RESOLV）是在超临界流体快速膨胀法上改进而来，后者将喷嘴置于空气中，而前者改进后将喷嘴置于水溶液中。超临界流体的压力、温度、流速、喷嘴的形态和直径等都会影响纳米晶体的粒径和收率。

该方法的优点在于技术简单成本较低，且使用无害的溶剂，不会残留任何有机溶剂。缺点是超临界流体的消耗过大，并且仅适用于能溶于超临界流体的药物。

（3）溶剂蒸发法和喷雾干燥法

溶剂蒸发法和喷雾干燥法（Solvent evaporation and spray drying）是利用物理方法除去药物溶液中的溶剂，使药物结晶形成纳米晶体的一种技术。

喷雾干燥技术广泛应用于纳米晶体的生产，这其中涉及流体在热的干燥气体中经雾化器雾化，雾化流速、雾化器直径、流体特性和设备都影响着纳米晶的粒径和形态。NanoCrySP是最近发展起来的用于制备纳米晶体的喷雾干燥技术，将药物溶液和小分子一起喷洒促进核的形成，最终将药物纳米晶体形成小分子固体分散体。该方法的缺点是必须加入稳定剂避免晶体团聚，并且利用气旋收集纳米晶体也是一个难题，需要开发功能更为全面的喷雾干燥器提高收率。

冷冻干燥是另一种蒸发溶剂制备纳米晶体的技术。该方法将有机溶剂溶解的药物与冻干保护剂的反溶剂混合，混合溶液快速冷冻并干燥，在冷冻或者干燥的过程中药物结晶，冻干保护剂的含量和冷冻速率是药物结晶的关键参数。冻干保护剂含量较高时，药物结晶发生在冷冻阶段；冻干保护剂含量较低时，药物结晶发生在干燥阶段。该方法的缺点是纳米晶体的粒径均一度较差，并且需要优化参数才能实现对粒径的精准控制。

表2 分散法的优缺点对比

3. 结合法

结合法是将分散法和沉淀法结合起来，通常以沉淀法制备粗晶体，分散法再控制产品粒径和存在形式，形成粒径小且均一的纳米晶体。

图9 结合法

（1）NanoEdge技术

NanoEdge技术由沉淀法和高压均质法结合而成，沉淀法先形成微米级别的晶体粒子，再利用高压均质的均质作用提高药物晶体粒径的均一度，增加产品稳定性。此方法由Baxter于2003年发明成为首个组合技术，并且成功用于商业化生产。沉淀法形成的药物颗粒，多为非晶或者半结晶状态，经过高能退火后，药物粒子转变为稳定性更好的晶体状态。如其他沉淀法一样，有机溶剂在混悬液中的残留是其最明显的缺点。

（2）H69技术

H69技术（PharmaSol）的全名是高压空化沉淀−均质组合技术，类似于NanoEdge技术，由沉淀法和高压均质法结合而成。与NanoEdge技术的区别在于，沉淀法和均质法几乎同时作用于药物粒子，或者说药物颗粒的沉淀发生在均质器的高压区域。沉淀法刚形成药物颗粒，粒子便受到均质器的高压空化作用、冲撞力和剪切力作用，控制晶体成长，提高粒子均一度。H69技术是由Muller和MasChwitter公司开发的，它属于SwitcStand技术家族。

（3）H96技术

H96技术是由冷冻干燥法和高压均质法结合而成，由Möschwitzer和Lemke开发，属于smartCrystal技术家族。冷冻干燥处理会改变药物的物理性质，质地变得疏松多孔，且分散性更好。H96技术在冷冻干燥阶段多采用液氮进行冻干，可作为高压均质法减小粒径的预处理。该方法可避免使用有机溶剂，但冷冻干燥的工艺耗时较长。

（4）H42技术

H42技术是由喷雾干燥法和高压均质法结合而成，类似于H96技术，由Möschwitzer教授发明，归属于Pharmasol公司。H42技术先以喷雾干燥法将难溶性药物分散在稳定剂骨架中，将其分散成水溶液混悬剂，再经高压均质法控制药物纳米晶体粒径。该方法的优点是喷雾干燥不属于高耗能工艺，成本低，易于商业化生产。但是收率不高，批量越小收率越低，不适合小规模生产，并且不适用于热敏感药物。

（5）其他技术

因为纳米晶的制备方法众多，所以结合法的种类也较多。除了上述的技术结合外，还有很多其他的结合方式。

PLH技术：将沉淀法、冷冻干燥法和均质法结合在一起。先利用有机相和水相沉淀形成晶体，再利用冷冻干燥对晶体晶型改性和除去有机溶剂，最后再通过高压均质控制产品粒径。

CT技术：将介质研磨法与高压均质法结合在一起。先利用介质研磨技术预处理得到粗纳米晶体混悬液，再经高压均质控制粒径得到均一稳定的产品。

ARTcrystals技术：将转子-定子高速剪切法与高压均质法结合在一起。先利用转子-定子高速剪切法对药物混悬液进行预处理，再经高压均质控制粒径得到均一稳定的产品。

超声法联合反溶剂沉淀技术：在利用反溶剂沉淀法形成粗纳米晶体，同时利用能量高、穿透性强的超声波对晶体形成空化作用，溶液在负压下形成空泡，空泡破裂时释放能量和冲击波，加强溶剂混合，且减小药物晶体粒径。

表3 结合法的优缺点对比

表4 纳米晶各制备方法的专利