白蛋白纳米粒的制备方法有：去溶剂法、乳化法、自组装法、凝胶法、喷雾法和Nab^TM技术。

图10 白蛋白纳米粒制备技术

1. 去溶剂法（Desolvation）

去溶剂法（Desolvation）的实质是利用白蛋白在有机溶剂和水溶液中理化性质的差异来形成白蛋白纳米粒。水溶性的白蛋白不溶于有机溶剂，甚至会在有机溶剂中变性聚集，形成沉淀。

去溶剂法常见的制备过程是将有机溶剂滴入到白蛋白溶液中，随着有机溶剂比例的增加，白蛋白的溶解度下降，导致变性和聚集。这一步也有描述为作为脱水剂的有机溶剂除去白蛋白的水化膜，使白蛋白的疏水性区域暴露而析出。此时加入交联剂，白蛋白侧链上赖氨酸残基的氨基部分和精氨酸的胍基部分与醛基发生缩合反应，从而固化白蛋白形成纳米粒。最后除去有机溶剂和残留的交联剂，对纳米粒进行纯化，收集白蛋白纳米粒。

有机溶剂（脱水剂）是该制备方法的关键因素之一。有机溶剂的比例与纳米粒的粒径极为相关，高比例的有机溶剂加快白蛋白的脱水速度，形成的纳米粒子粒径较大。常用的有机溶剂是甲醇、乙醇、丙酮等等，其中甲醇因较高的介电常数，使有机溶剂和水性介质混合物的极性变化极为缓慢，形成的粒径小于100nm，而选用丙酮时形成的白蛋白纳米粒的粒径在140~300nm范围内。

交联剂的选择是该制备方法的另一个关键因素。交联剂决定着纳米粒子的稳定性、生物降解性和药物递送系统的释放度。因戊二醛交联的纳米粒物理特性良好，被作为交联剂广泛使用，但戊二醛在很多细胞系中表现出细胞毒性和基因毒性，导致制备的产品因安全性考虑无法使用于临床。其他潜在的交联剂有葡萄糖、甲醛，或者谷胱甘肽交联白蛋白的二硫键。另外的一种策略是选用物理交联方法，比如干燥、加热、紫外辐射。

去溶剂法多适用于包载递送疏水性药物，操作简单，制备步骤少，反应速度快，不需要特殊设备。就目前而言，尽管交联剂本身的用量不高，且属于环保化学试剂，但无法彻底除去是制约其广泛应用的主要原因。

图11 去溶剂法

2. 乳化法（Emulsification）

乳化法（Emulsification）的实质是将两种或者两种以上不可混溶的溶剂混在一起，乳化后分散到另一种溶剂中。乳化法制备白蛋白纳米粒是将白蛋白水溶液和药物水溶液加到含有适量乳化剂的油相或者有机溶剂中，以搅拌、超声或者高压均质等方式使其乳化，形成油包水（W/O）乳剂，再通过化学交联或者加热变形的方式使乳滴固化，最后除去残留的有机溶剂，收集白蛋白纳米粒。常用的油相多为植物油，有机溶剂多为乙酸乙酯和氯仿，而表面活性剂多用聚乙烯醇和吐温80，但这些溶剂和辅料的使用会影响白蛋白本身的生物活性。

近来，有采用水包油包水（W/O/W）复乳法制备白蛋白纳米粒，这种方法类似于多囊脂质体的制备方法。先制备W/O的初乳，在表性活性剂保护乳滴稳定的情况下将初乳分散到第二水相中，形成水包油包水的复乳。之后除去有机溶剂，白蛋白纳米粒在水溶液逐渐形成。

图12 乳化法

因为乳滴的不稳定特性，必须要表面活性剂或者是稳定剂来维持乳滴的稳定。表面活性剂和纳米粒粒径会影响药物在生理环境中的释放行为，而白蛋白的浓度、油水相比例与纳米粒粒径密切相关。

乳化法适用于疏水性药物，应用较为广泛。但是乳化过程会破坏白蛋白的稳定性，并且纳米粒的微观形态很难控制，使得该法可重复性较差，批间差异大。

3. 凝胶法（Gelation）

凝胶法（Gelation）根据处理方式的不同，可分为热凝胶法（Thermal gelation）和pH凝胶法（pH- gelation）。

热凝胶法是加热条件下使白蛋白变性聚集形成纳米粒的一种方法。对白蛋白溶液进行加热处理，心形白蛋白内的α-螺旋、β-折叠和肽链构象会逐渐展开形成凝胶，白蛋白的整个聚集过程与非共价键（如疏水性、静电作用和氢键结合，编者个人认为：氢键是键能弱于共价键但强于分子间作用力的一种范德华力）和共价键（二硫键）相关。

pH凝胶法是通过调节溶液体系的酸碱度，使白蛋白沉淀形成纳米粒。蛋白的沉淀聚集取决于分子间的二硫键，溶液的温度和酸碱度影响着二硫键的状态。一般情况，碱性条件下，带负电荷的白蛋白会互相排斥，蛋白分子结构展开，诱导二硫键引起分子聚集，形成结构更为稳定的白蛋白纳米粒。此外，白蛋白是具有多个带电官能团的两性大分子，通过调节蛋白电荷可以与其他聚合物静电作用形成复合物，成为一种具有生物相容性的复合药物递送系统，目前的研究中主要用于促进生物活性处理和基因物质的递送。

凝胶法的最大问题是无法通过调节温度和酸碱度来精准控制白蛋白纳米粒的粒径，而pH凝胶法多在高浓度白蛋白溶液中进行，普通的玻璃电极测定pH值会存在较大数据偏差。

4. 喷雾法（Spraying）

根据采用设备的不同，可将喷雾法分为纳米喷雾干燥法（Nano Spray Drying）和电喷射法（Electrospraying）。

纳米喷雾干燥法（Nano Spray Drying）是一种将白蛋白溶液直接处理成纳米粒的技术。白蛋白溶液经喷雾干燥仪的喷嘴形成喷雾进入设备内室中，加热的氮气和二氧化碳气流对喷雾进行处理后流向底部。而底部有电极专门收集纳米粒，在电极的引导下实现白蛋白纳米粒的富集。这种技术可以通过控制气流实现全程温度控制，适用于温敏药物。可以通过调整喷嘴的尺寸、气体温度、白蛋白浓度和流速来控制白蛋白纳米粒的粒径。如需改善白蛋白纳米粒，可以加入适量表面活性剂，表面活性剂会将纳米粒的形态尽可能维持球体，增加纳米粒子稳定性。与其他方法不同的是，纳米喷雾干燥法也适用于水溶性药物。

电喷射法（Electrospraying）是一种外加高电压使液体雾化的技术。具体过程是在高电压条件下，将白蛋白溶液经仪器喷嘴喷射形成雾化液滴，雾化液滴中含有胶状的白蛋白纳米粒，除去溶剂后即可固化纳米粒。电喷射法制备白蛋白纳米粒类似于电辐射制备纳米结构载体，包封率较高，纳米粒的稳定性和重现性良好，喷嘴尺寸、电压强度、流速等可控参数影响产品的质量。

图13 喷雾法

5. 自组装法（Self‑assembly）

自组装法（Self‑assembly）的实质是白蛋白溶液在超过临界胶束浓度(Critical micelle concentration, CMC)和临界共溶温度(Critical solution temperature, CMT)的情况下，会自发形成结构更为明确和稳定的纳米团聚体，即纳米粒。

自组装法常用的方法是通过加入还原剂还原白蛋白的二硫键、加入变性剂或者脂溶性药物来减少白蛋白表面的伯胺基团，增加白蛋白分子的疏水性，诱导分子间非共价相互作用形成白蛋白纳米粒，其中的疏水性区域可以包载疏水性药物分子。常用的还原剂如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸，

自组装法的特点是白蛋白纳米粒由纳米胶束固化而来，所以柔性好粒径小，纳米粒能穿过生理屏障，高效地将药物递送至生物组织和器官内。但该方法存在的问题是还原剂的使用，残留的还原剂存在一定的安全隐患。

图14 自组装法

6. Nab^TM技术（Nab™technology）

Nab^TM（Nanoparticle albumin‑bound technology）技术是由American Bioscience公司开发的一种以白蛋白为载体包载疏水性药物的结合型纳米粒制备技术，该公司基于这种技术，已成功研发经FDA批准上市紫杉醇白蛋白纳米粒（Abraxane）。

Nab^TM技术的具体过程是将疏水药物溶解于有机溶剂中，注入到白蛋白水溶液中，油水相混合经搅拌或者剪切制备成粗乳滴，再经高压均质技术（超声、高压均质、微射流等）控制粒径，最终除去有机溶剂（蒸发、洗滤、冻干）即可得到白蛋白纳米粒。均质是该技术的核心步骤，其基本原理是利用均质时的气穴空化作用，使白蛋白的游离巯基交联形成二硫键，在白蛋白彼此交联的过程中，将药物包裹在纳米粒内部。这种交联方式属于化学键的自发重组，不影响白蛋白自身的生物学特性。粒径是该技术需要中控的硬性指标，如果粒径较大，过滤除菌时会出现刚性结构的纳米粒大量截留甚至堵塞的情况，严重影响产品的收率。

该方法最大的优势是不会引入交联剂，尽管可能存在溶剂残留问题，但优于其他方法的安全性。该方法的缺点也很明显，对设备的要求较高，而且均质过程中可能会因白蛋白聚集引发冻干后产品难以分散的问题。此外，该方法主要适用于蛋白结合率较高的疏水性药物，蛋白结合率不高的药物无法实现高效率包载。

在Nab^TM技术的基础上，近年有将微流控技术引入白蛋白纳米粒的制备技术中，但目前鲜有相关产品报道。Nab^TM技术和微流控技术的最大差别，是前者在均质前先两相混合，经高能量将大粒径纳米粒变小；而后者是将两相同时经高压输送泵进入微流控中，在管线中实现两相混合，混合液在芯片中达到湍流、层流或者雾化状态，经高压输送泵的作用，药液通过撞击力和剪切力来减小粒径。虽然微流控技术可以实现对制备过程中具体参数的控制，但制备过程是在高压下完成，样品流出设备后在常压下的稳定性是否能满足要求，是验证该技术能否用于大规模生产的主要数据支撑。毕竟纳米粒是刚性结构，不同于脂质纳米粒、脂质体、胶束等柔性药物递送系统。

除了这六种制备方法，还有其他不常用的制备方法，例如聚合物分散法和超声法。

聚合物分散法是指将白蛋白水溶液加入到含有聚合物（常用聚甲基丙烯酸甲酯）的分散介质中，振荡混合后形成白蛋白微球，将白蛋白微球添加到含有交联剂（常用戊二醛）的有机相中进行化学交联，洗涤干燥后收集白蛋白纳米粒。超声法是指将脂溶性药物溶解于有机相中，再将白蛋白水溶液和其中需要的辅料加入到溶解药物的有机相中，经搅拌和超声乳化后，除去有机溶剂，干燥后得到白蛋白纳米粒。