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2023-11-15 11:13:08

药物递送之mRNA疫苗递送制备技术

三 制备技术


1.生产流程
根据纽约时报公开的信息，疫苗的整个生产流程从质粒的提取繁殖到最终的疫苗，一共可分为如下几步：
Step 1：将含有病毒的核酸序列的质粒，注入到大肠杆菌中，这里的质粒可以是从病毒中提取，但更安全有效的方法是根据发表的核酸序列优化设计直接连接到质粒上，避免跟病毒直接接触；
Step 2：在温暖适宜的条件下，大量繁殖生长携带了质粒的大肠杆菌；
Step 3：将上述生长繁殖的大肠杆菌转移至体积更大的营养液里，适宜条件下存放发酵，使其复制亿万级别的质粒；
Step 4：发酵结束后，加入酶或者其他化学物质分解大肠杆菌细胞壁，收集并纯化质粒；
Step 5：检测上述的质粒，确保质粒携带的基因序列未发生变异，能够用于后续的疫苗生产；
Step 6：加入限制性核酸内切酶，从环状的质粒中切割出直线段的病毒基因，并除去残留的细菌和质粒片段；
Step 7：根据“中心法则”，以DNA为模板转录成mRNA；mRNA进入人体，其携带的病毒基因即可在体内翻译出病毒蛋白，即为抗体，用于中和病毒；mRNA也需进行质量中控，确保能用于后续的疫苗生产；
Step 8：准备脂质，用于保护mRNA进入体内时不会被破坏；
Step 9：精确的控制着mRNA和脂质流速，将他们混合成脂质纳米粒。

图片


2.mRNA/LNP的制备
mRNA/LNP传统的制备方法是两相混合再经均质技术（高压均质机、高压微射流）或者挤出技术（聚碳酸酯膜过滤器）控制粒径。该法制备的纳米粒形成多层结构，mRNA分子夹在同心脂质双层。该方法包封率普遍不高，并且需要高精度高专业化的设备，导致工艺放大困难。

另一种方法是乙醇稀释法。将各种脂质溶解在乙醇中，mRNA溶于酸性水缓冲液中，将两相快速混合。通过稀释乙醇相，脂质的溶解度降低，在混合溶液中逐渐析出凝固并形成脂质纳米粒，同时高效包载mRNA。再经缓冲液膜包超滤除去残留的乙醇，中和缓冲液的pH值。
目前，商业化生产大批mRNA/LNP利用微流体或T型接头混合，作为新型的微流体设备，该制备方法快速简便，对于疫苗这类小剂量药物具有明显优势。

表七 Pfizer-BioNTech和Moderna上市疫苗缓冲液中辅料

公司

Pfizer-BioNTech

Moderna

缓冲液成分

氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、二水磷酸钠、蔗糖、注射用水

三乙醇胺、三乙醇胺盐酸盐、乙酸、乙酸钠、蔗糖、注射用水


对于mRNA/LNP的形成机制，有学者提出，两相在酸性pH条件下快速混合，会形成“中空”结构的小粒径脂质体和与“非中空”的电子致密大粒径颗粒。膜包超滤过程中，随着pH的中和，颗粒发生融合，最终形成mRNA/LNP系统。


写在最后


尽管均为mRNA疫苗，但BioNTech和Moderna的mRNA疫苗存在差异：

表八 Pfizer-BioNTech和Moderna上市疫苗差异对比

对比项

Pfizer-BioNTech

Moderna

有效率

95%

94.1%

储存

-70℃

-20℃（6M）

2~8℃（1M）

常温（12h）

价格

$19.5/剂

$25~37/剂

产能（2021）

13亿剂

5~10亿剂

一季度销售

$34.62亿

$17.33亿


除了BioNTech和Moderna的mRNA疫苗，其他公司也在研发或者已经上市类似产品。国内上市的都是传统灭活病毒疫苗，mRNA疫苗仍处于临床研究阶段，目前研发进度最靠前的是艾博生物，5月已进入III期临床阶段。


2021年5月10日，上海复星医药（集团）股份有限公司在上交所发布公告称，控股子公司复星医药产业拟与德国拜恩泰科（BioNTech）投资设立合资公司，以实现mRNA新冠疫苗产品的本地化生产及商业化。

表九 国内mRNA疫苗在研情况

公司名称

递送技术

I期临床获批

艾博生物

LNP

2020.06

斯微生物

LPP

2021.01

立凡达生物

LNP

2021.03

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2021年5月5日，美国表示为了尽快普及安全有效的疫苗，结束新冠肺炎疫情，美国将放弃新冠肺炎疫苗的知识产权专利。但知识产权是全球新冠肺炎疫苗短缺问题的一部分，但更大的问题在于制造业。另外，从上面两张“公关人员飞行图”和“销售人员飞行图”可知，mRNA疫苗的专利错综复杂，并非全系美国。

宾夕法尼亚大学的Katalin Karikó和Drew Weissman教授作为mRNA技术的奠基者，拥有编码mRNA的核心专利，该核心专利几经转让，最终到了Moderna和BioNTech手中。
2019年，在美国著名病毒专家福奇带领下，依托强大的研发能力及数据积累优势，构建了新冠病毒棘突蛋白，并申请了专利，已上市的BNT162b2和mRNA-1273均应用该相关专利。
mRNA体内递送载体LNP方面，由加拿大的不列颠哥伦比亚大学和Arbutus公司于1998年共同完成，后辗转授权给了Moderna和BioNTech。
目前上市的疫苗并非终身免疫，新冠将逐渐常态化，新冠疫苗依旧是一块甜美的“蛋糕”。
而作为mRNA高效载体的LNP，它的作用绝非只能用于基因递送或者大分子药物，相信随着相关技术越发成熟，LNP技术信息透明的时候或许就是它运用于其他药物递送的时候。


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