药物递送之mRNA疫苗递送技术简介

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2023-11-15 11:10:16

药物递送之mRNA疫苗递送技术简介

mRNA分子量大，亲水性强，生物活性是小分子药物的上千倍，工业生产比较容易。但自身的单链结构致使其极为不稳定，易被降解，自身携带负电荷，穿过表面同为负电荷的细胞膜递送亦是难题。

所以需要特殊的修饰或包裹递送系统才能实现mRNA的胞内表达，改变mRNA胞内的生物分布、细胞靶向和摄取机制，促进mRNA的递送，发挥疫苗的效果。

目前常用的递送技术有电穿孔（Electroporation）、鱼精蛋白(Protamine)、阳离子纳米乳液(Cationic nanoemulsion)、阳离子聚合物脂质体(Cationicpolymer liposome)等。电穿孔是将mRNA分子通过高压脉冲形成的膜空隙，直接进入人体细胞发生的转染。其余方法都是保护mRNA分子胞外降解，或者促进mRNA分子与细胞膜融合提高转染。

随着两款mRNA疫苗被批准用于接种预防新冠病毒，LNP无疑是目前最热门的递送技术。

表四部分在研或上市LNP技术的mRNA疫苗

疫苗名称	适应症	研发公司
mRNA-1273	COVID-19	ModeRNA
SARS-CoV-2		CureVac AG
BNT-162b1		BioNTech
BNT-162b2
BNT-162b3
Tozinameran
ARCT-021		Arcturus
mRNA-1647	巨细胞病毒感染	ModeRNA
mRNA-1443	巨细胞病毒感染	ModeRNA
mRNA-1345	代谢病毒感染副流感病毒感染	ModeRNA
mRNA-1653	代谢病毒感染副流感病毒感染	ModeRNA
mRNA-1440	传染病	Valera LLC
mRNA-1851	传染病	Valera LLC
mRNA-1325	寨卡病毒感染	ModeRNA
mRNA-1893	寨卡病毒感染	ModeRNA
CV-7202	狂犬病病毒感染	CureVac AG
mRNA-1388	基孔肯亚病毒感染	Valera LLC
mRNA-1172	呼吸道合胞体病毒感染	ModeRNA

信息来源：丰硕创投

1.mRNA/LNP的组成和结构

准确说来，载mRNA的脂质纳米粒（Lipid nanoparticle,LNP）除了含有带负电荷的mRNA外，另有四种成分：可电离的阳离子磷脂（ionizable lipids），中性辅助磷脂，胆固醇，聚乙二醇修饰的磷脂（PEGylated lipid）。

表五 LNP各组分的比例

组分	所占比例
阳离子磷脂（可电离）	约50%
辅助磷脂（中性）	约10%
胆固醇	约38.5%
PEG化磷脂	约1.5%

信息来源：Vaccines

表六 Pfizer-BioNTech和Moderna上市疫苗成分对比

组分		Pfizer-BioNTech	Moderna
活性成分		BNT-162b2	mRNA-1273
辅料	阳离子磷脂（可电离）	ALC-3015	SM-102
	胆固醇	√	√
	PEG化磷脂	ALC-0159	PEG2000-DMG

信息来源：公开资料

脂质纳米粒中辅料的作用与该类辅料在脂质体中的作用类似：中性辅助磷脂一般为饱和磷脂，可提高阳离子脂质体的相变温度，支持层状脂质双层结构的形成并稳定其结构排列；胆固醇有较强的膜融合性，促进mRNA胞内摄入和胞质进入；PEG化磷脂位于脂质纳米粒表面，改善其亲水性，避免被免疫系统快速清除，防止颗粒聚集，增加稳定性。最关键的辅料是可电离阳离子磷脂，它是mRNA递送和转染效率的决定性因素。

2.mRNA/LNP的递送

（1）可电离阳离子磷脂

可电离阳离子磷脂是决定mRNA递送和转染效率的关键因素，该阳离子磷脂需要在生理条件下（pH=7.4）不电离，而在酸性条件下（≤5.0）发生电离。目前已有多种可电离的阳离子磷脂被开发。

由化学结构可知，可电离阳离子磷脂至少含有一个叔胺，有的还含有一个或多个仲胺，且有能发生水解反应的羧酸酯（除C12-200外）。在酸性环境下，叔胺质子化，磷脂形成一个较小的两性离子头部和一个疏水链尾部，形成一个锥形结构，促进膜向六方晶相转变从而实现高效递送和转染。

羧酸酯的存在保证磷脂在体内的可降解性，避免磷脂的蓄积引起毒副作用。利用2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸（TNS）检测磷脂的实际酸度系数（pKa），在6~7范围内。可电离阳离子磷脂的极性属于pH响应型，在酸性环境中，携带正电荷，可与mRNA静电络合形成复合体，稳定mRNA分子。在中性生理条件pH值下，属中性，减少其毒副作用。

（2）mRNA/LNP的递送原理

入胞前，阳离子脂质可实现与带负电荷的mRNA分子静电络合，形成复合体，提高mRNA分子的稳定性。

mRNA/LNP到达细胞膜时，阳离子磷脂与带负电荷的细胞膜触发膜融合，细胞膜去稳定化，促进mRNA分子的递送。

内化进入细胞后，随着含有多种水解酶的溶酶体分解外源和外源大分子，pH值降低形成偏酸环境，使可离子化的脂质质子化，LNP的双层结构遭受破坏，释放mRNA，按照“中心法则”与负责生产蛋白的核糖体结合，翻译成病毒蛋白，即抗体，中和病毒。

（3）mRNA/LNP的炎症和基因编辑疗法

科学家在对小鼠进行LNP皮内给药后发现，存在大量的中性粒细胞浸润，多种炎症途径的激活以及各种炎症细胞因子和趋化因子的产生。鼻内给药时，也观察到类似情况。Pfizer/BioNTech或Moderna疫苗肌肉接种后，在小鼠皮内接种后导致促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、巨噬细胞炎性蛋白-1α和巨噬细胞炎性蛋白-1β的分泌。

研究人员发现LNP的炎症特性并不是特定部位的，他们猜测这可能是SARS-CoV-2疫苗的副作用，归因于其强大的辅助活性及其优越性，LNP的高效率递送引起较强的保护性免疫反应，确切机制还需要进一步的研究来确定。

目前对LNP递送的机制研究主要集中在保护mRNA和提高转染方面，但由2020年诺贝尔化学奖得主Jennifer Doudna博士联合创建的Intellia Therapeutics公司近日宣布，他们将Cas9mRNA和single-guide RNA (sgRNA)通过NanoAssemblr成功包载在由阳离子磷脂等多种磷脂组成的LNP中。

制备的CRISPR LNPs (cLNPs)能够特异性地将CRISPR基因编辑疗法递送到骨髓中，从而增强对造血干细胞和骨髓细胞的基因编辑。对于开发治疗像镰刀型细胞贫血病（SCD）等遗传性血液疾病的疗法来说，这一突破有望克服与体外基因编辑相关的操作复杂性和安全性。

（4）新冠疫苗存在的争议隐患

2021年5月25日，《Cell》杂志报道了日本学者的一篇论文（An infectivity-enhancing site on the SARS-CoV-2spike protein targeted by antibodies），论文阐述了感染新冠病毒的患者可能出现抗体增强，存在潜在的ADE效应。

何为ADE效应？ADE（Antibody-DependentEnhancement），即为抗体依赖增强。

我们都知道病毒感染是从接触和黏附开始的。病毒表面蛋白与靶细胞上特异性受体和配体分子黏附后相互作用，发生病毒感染。而疫苗策略就是开发针对病毒表面蛋白的特异性抗体，中和病毒，使其失去感染能力。然而有的时候抗体在抑制病毒感染过程中却是发挥了相反的作用，它们协助病毒进入细胞，提高病毒感染率，该现象即为抗体依赖性增强作用。

科学家之所以对ADE效应表示担忧，是因为曾在猫感染性腹膜炎冠状病毒（FIPV）感染过程和抗登革热病毒蛋白的抗体中发现了该现象。当时发现Fc受体（对免疫球蛋白Fc部分c末端的受体）介导诱发了ADE，证明了增强冠状病毒感染抗体的存在。对ADE效应发生的确切机制尚需继续探索，且目前并未在感染病例和接种疫苗后感染病例中发现ADE，但科学界对这种效应的担忧仍是有道理的。

3.其他递送技术

目前最常用的mRNA疫苗递送手段除了脂质纳米粒（Lipidnanoparticle，LNP），还有阳离子脂质复合物(lipoplex，LPX)、脂质多聚复合物(lipopolyplex，LPP)、聚合物纳米颗粒（Polymer nanoparticles，PNP）、无机纳米颗粒（Inorganic nanoparticles，INP）阳离子纳米乳(Cationic nanoemulsion，CNE)等。

（1）聚合物纳米粒（PNP）

聚合物纳米粒因易于合成，成为mRNA递送的载体。选用的聚合物体内降解而不会产生有毒成分。聚合物纳米粒可以与核酸mRNA结合，在生理pH下形成多聚复合物，以促进基因递送。通常情况下，聚合物纳米粒带正电荷，以促进与mRNA的静电络合。通过使用可降解的连接物，也可实现mRNA与聚合物的共价连接。

（2）脂质多聚复合物（LPP）

脂质多聚复合物是我国斯微生物拥有自主知识产权的递送技术。该技术是一种以聚合物包载mRNA为内核、磷脂包裹为外壳的双层结构。相比传统LNP具有更好的包载、保护mRNA的效果，并能够随聚合物的降解逐步释放mRNA分子。LPP平台优异的树突状细胞靶向性可以更好地通过抗原递呈激活T细胞的免疫反应，从而达到理想的免疫治疗效果。

（3）无机纳米粒（INP）

无机纳米粒由无机颗粒和可生物降解的聚阳离子合成，例如金属磁性纳米颗粒。最常见的是介孔硅纳米粒，介孔硅纳米粒具有孔道均匀、易于官能化、生物相容性、高比表面积、大孔容和可生物降解性等特性。为提高对mRNA的递送和转染效率，通常在其表面或者孔道内包裹阳离子聚合物。

（4）GalNac技术

GalNac是N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine）的缩写，国内的瑞博生物有自主研发的GalNac递送技术平台。该平台是基于GalNAc与小核酸共价连接，GalNac可以与实质肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）特异性结合，实现细胞的快速胞吞。该技术具有高度的肝靶向特异性，给药后高效富集到肝组织，进入其他组织的量非常少。

最早采用ESC-GalNac递送技术的是美国Alnylam公司，这是一种靶向修饰技术，其产品Lumasiran是一种皮下注射的治疗原发性1型高草酸尿症（PH1）的RNAi药物，已在欧洲获批上市。