脂质体技术在药物递送及诊断中的应用（四）

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2023-11-14 14:11:50

脂质体技术在药物递送及诊断中的应用（四）

脂质体载药

药物包封率、无菌性、药物保留性、制备方法和可否规模化生产，脂质体稳定性和成本及有效性都取决于脂质体中载药方法的选择。将药物加入脂质体有两种不同的方法，即被动载药法和主动载药法。在被动载药方法中，药物在制备过程中被包封在脂质体中。在主动载药方法中，药物被装载到完整的脂质体中（主动负载）。

//被动载药技术：

是否采用被动载药技术，取决于脂质体在形成期间包封特定体积水相的能力，水相中含有溶解的药物或溶质。对于亲水性药物，经被动载药脂质体包封率与脂质体所在的水相体积有关，脂质体本身性质取决于分散体系的磷脂浓度、层室数和脂质体形态。

亲脂性药物与磷脂双层相互作用，因此，包封率取决于磷脂类别及其浓度。形态学参数不影响药物包封率。使用被动载药技术，水溶性药物被包裹在脂质体的水相内，而脂溶性药物被包裹在脂质体的双层（脂质相）中。药物或生物活性物质脂溶性部分将嵌入脂质体磷脂之间，而它们的水溶性部分位于脂质体水相中，从而被包封。

// 主动载药技术：

对于活性药物的包封，将已经制备的空白脂质体与药物浓溶液混合，孵育一段时间后，药物通过扩散过程均匀分布在脂质体中。该方法较佳，因为磷脂双层对药物扩散具有高度渗透性，因此，在适宜的时间内可达到较高包封率。由于浓度梯度，药物可通过脂质双层渗透到脂质体中，直到周围介质和脂质体内部之间达到平衡。

在主动负载时，水溶性药物与磷脂的极性头部基团相互作用而无法进入脂质体内部。能够进入脂质体的疏水性药物的量，取决于脂质双层的空间限制程度。对于两亲性药物的情况，它们难以保留在脂质体内，因为它们可以快速渗透脂质双层。

该方法具有许多优点，如在脂质体的制备过程中并不加入活性成分，因此处理毒性药物时必须采取的安全预防措施可以降至最低。这种方法的缺点在于它仅限一小部分表现为两性弱碱性或酸性的药物，只能在不带电的情况下渗透双层，而不能在带电的情况下渗透。

脂质体的表征

为了对脂质体制剂进行适当的质量控制，需要在制备和储存后对其进行充分的表征。在分析和生物分析领域中应用的脂质体，主要特征包括平均粒径和多分散系数、包封率和层状度测定。其他常用的检测参数包括通过Zeta电位测量表面电荷、通过差示扫描量热法（DSC）测定相转变等。这里详细给出了参数的表征方法。

//脂双层测定：

在该方法中，将磷脂膜沉积在电极上，随后在电场作用下，水化几个小时。尽管通过施加交流电和直流电能形成巨大的单层脂质体，但直流电场有一定的不足，由于水电解而发生起泡。电形成法制备出的脂质体80%是较完美的单层脂质体。

// 脂质体粒径大小和粒径分布：

脂质体的平均直径及其分布是脂质体制剂的关键参数，尤其是当它们通过非肠道给药途径或吸入给药时更为重要。采用不同的方法可考察脂质体的平均大小和粒径分布。这些技术包括显微镜观察、静态或动态光散射、粒径尺寸排阻色谱（SEC）和场流分离技术。

为了得到关于脂质体在粒径大小和分布方面的一些较好和可靠的结果，可使用包括透射电子显微镜（TEM）、冰冻蚀刻透射电镜、负染色和冷冻电子显微镜等方法。这些技术能够为脂质体提供准确的结果，因为用它们可观察脂质体形态并且可以分辨不同大小的粒子。另一方面，样品制备比较复杂。此外，由于使用这些方法会产生伪影，引起收缩和变形，并且获得代表性粒径大小分布耗时较长，因此，不适于常规测量。在样品制备中多加注意可以解决部分问题，获得可重复且准确的结果。最近，原子力显微镜（AFM）技术已被用于研究脂质体形态、大小和稳定性。AFM，为分辨率接近0.1nm的扫描探针显微镜，无须处理样品，也能在自然环境中实现对小脂质体的可视化，可得到脂质体表面的高分辨率三维轮廓。该技术可在不改变其原始存在形式的前提下，实现脂质体可视化；必要的表面固定不会对样品产生不利影响，而且探针本身也不会对脂质体产生不良影响。AFM分析是一种相对无创的技术，功能强大，速度快。它可以提供有关形态、大小及脂质体储存期间可能发生聚集过程的信息。

//转变温度：

磷脂如两亲性分子具有在低于其熔点的温度下经历热致转变的独特特征。烃链的化学性质极大地影响着转变温度。酰基链的长度、烃链中不饱和度、分子的极性区域、烃链上甲基直链及悬浮介质的性质和离子强度对转变温度具有重要影响。当链长减小时，转变温度较低。同样地，支链和庞大侧基的存在及酰基链的不饱和度也降低了转变温度。与反式-不饱和烃尾基相比，顺式-不饱和烃尾基的转变温度较低。脂质体的制备和应用受磷脂膜的转变和流动性的影响较大。脂质体囊泡的特性如聚集行为、蛋白质结合模式和融合与渗透性由磷脂的转变温度决定。

较低的转变温度对脂质体是有利的。与具有较低转变温度的磷脂相比，具有较高转变温度的脂质体释药更慢。因此，脂质体转变温度的测定对于具有所需性质的制剂是至关重要的。为了测定磷脂的转变温度，广泛采用DSC方法。

//表面电荷：

脂质体可以是中性的、带正电的或带负电的。通过使用磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱获得中性表面囊泡。具有带负电荷表面的脂质体可以用酸性磷脂如磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油或十六烷基磷酸酯获得。磷脂如二油酰基三甲基铵丙烷或硬质酰胺，用于制备带正电荷表面的脂质体。表面电荷是一个重要参数，因为它决定了脂质体的包封率和稳定性。当脂质体和带电药物之间存在静电吸引力时，药物包封率增加。脂质体表面的电荷密度和各种离子与脂质体的结合亲和力可通过测量Zeta电位这一参数来确定。

// Zeta电位：

粒子的Zeta电位是粒子在特定介质中获得的总电荷。它是混悬状态的粒子所表现出的物理性质。人们早已认识到，Zeta电位的测量通常用于预测胶体系统的稳定性。如果混悬液中的所有粒子都具有较大的负或正Zeta电位，那么它们将倾向于相互排斥并且不会聚集。但是，如果粒子具有较低的Zeta电位值，那么斥力不足以防止粒子絮凝。

对于Zeta电位测定，使用激光来作为照射样品内的粒子的光源。入射激光束穿过样品池的中心，并检测到约13°角的散射光。当向池内施加电场时，任何移动通过测量容积的粒子将产生光的波动信号，其频率与粒子速度成比例。将该信号传递给数字信号处理器，然后经计算机计算，从而得到Zeta电位数值。

//脂双层流动性：

脂双层流动性研究是考察磷脂分子链在双层中的动力学行为和有序性。脂质体的组成影响脂双层的流动性，这方面研究较广泛。向磷脂膜中添加胆固醇能降低脂肪酸烃链之间的范德华相互作用，从而防止脂质体结晶，对脂双层流动性产生重要影响。同样地，将一些流体脂质添加到脂质体双层中，它们会干扰屏障功能，从而增加其流动性并降低其转变温度。脂质体的药物释放行为由脂双层的数量、流动性和渗透性决定。关于脂双层流动性的研究使用了多种技术手段，包括H-NMR光谱、EPR和去极化荧光。其中，EPR是确定脂双层流动性和结构变化的一种有效方法。

// 体外药物释放：

可以使用透析法进行体外药物释放。透析袋膜应在经过各种筛选后再选择，不应发生药物吸附，并且膜应该可以自由渗透活性成分（截留分子量不应该是扩散过程中的限制步骤）。将几毫升适量的脂质体分散液置于透析袋中，密封并置入含有释放介质的容器中。在持续磁力搅拌下将整个系统保持在37℃，封闭释放介质以避免溶解介质蒸发。在漏槽条件下进行动力学实验。在不同的时期间隔取样品，并通过高效液相色谱（HPLC）、分光光度计或任何其他简便的方法测定药物。用新鲜的溶出介质替换样品同体积的释放介质，以使受体隔室的体积保持恒定。每个动力学实验平行进行3次，取平均值以确定药物从脂质体中的释放曲线。

//包封率：

根据药物的极性和溶解度，药物可以多种方式与脂质体相互作用。药物或生物活性物质可以包封在脂双层中，插入极性头部基团，吸附在膜表面上，通过疏水尾部锚定，或包封在内部水性核心中。需要对脂质体性质进行广泛研究，以实现药物的最大包封并能预期实现控制其释放。磷脂的制备和组成都影响脂质体制剂的包封率。胆固醇在药物包封中的作用也很重要，因为将它加入磷脂膜可以提高包封率。由于部分药物仍保持游离状态，并未被包封，在确定包封之前，必须从脂质体制剂中除去游离药物。通过HPLC、荧光分光光度法和UV/VIS光谱法等分析技术对脂质体包封的药物进行定量测定，还可以使用荧光染料钙黄绿素测定脂质体的包封率。该方法通过添加钴阳离子对未包裹的钙黄绿素进行荧光猝灭，简单易行，在测定前不需要去除游离染料。

电子自旋共振光谱法也可用于确定脂质体的包封率，加入顺磁性试剂如铁氰化物可使外部自旋标记的标记物显著变宽。还可以利用二维扩散排序核磁共振光谱法考察包封率，测量原理基于包封和游离标记物质如蔗糖之间的扩散系数差异。也有学者提出一种快速简单的实验方法，使用1H-NMR结合pH敏感标记化合物（高聚肌氨酸）来确定脂质体的包封率，而无需物理分离游离包封标记物。