雷公藤红素（celastrol，Cel）是从雷公藤根皮中分离得到的五环三萜类活性化合物，分子式为C 29H 38O 4。现代药理研究表明，雷公藤红素具有抗肿瘤、抗炎、抗肥胖、免疫抑制及镇痛等药理活性，Cell杂志将其列为最有可能发展为药物的五种天然产物之一[1-5]。近年来，其抗肿瘤研究逐渐增多，雷公藤红素对前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等肿瘤细胞具有明显的抑制作用[6-10]。然而，在生物药剂学分类系统（BCS）中，雷公藤红素属于BCS II类，其难溶于水，溶出慢，生物利用度低及大剂量下的肝肾毒性限制了其临床应用[11-12]。近年来纳米载体的发展为雷公藤红素的应用提供了新方向。An等[13]制备了聚合物胶束用于雷公藤红素的递送以改善其水溶性，延长半衰期。Jin等[14]使用介孔二氧化硅装载雷公藤红素，制得的纳米粒子可改善其溶解度和生物利用度。

传统无机多孔材料如介孔二氧化硅、石墨烯等，其作为药物载体载药量高，但是存在体内不易降解等不足；有机材料如纳米脂质体、胶束等可体内降解完全，但载药量相对较低。金属有机骨架材料（metal organic frameworks，MOFs）作为一类新兴的多孔材料，近年来在药物载体领域发展迅速。其是由金属离子或金属团簇与有机配体通过配位键，辅助以范德华力或氢键等相互作用，自组装形成的一类具有无限周期性网络结构的聚合物材料。MOFs具有种类多样性、孔径可调、可表面修饰及大比表面积等优势，可兼顾载药量与体内可降解性。目前，研究较多的主要有IRMOFs系列（isoreticular metal organic frameworks）、MILs系列（material institute lavoisier frameworks）、ZIFs系列（zeoliticim idazolate frameworks）、PCNs系列（porous coordination networks）、UIOs系列（university of oslo）以及CPLs系列（coordinational pillared layers），见表1。

本研究选择在药物载体领域最常用的3种MOFs：UIO-66、ZIF-8与MIL-101（Fe），以粒径大小为指标，对其制备工艺进行正交优选，并对制备MOFs的晶体性质、形貌特征进行表征。筛选适宜MOFs，考察其对雷公藤红素的载药性能，同时对载药材料对HepG2细胞的细胞药效进行了初步评价，为后续体内外研究提供基础。

1仪器与材料

Mettler Toledo XP105型电子分析天平，梅特勒-托利多集团；DHG-9030A型鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜，上海予申仪器有限公司；真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；S3400扫描电子显微镜（SEM），日本日立公司；Zetasizer Nano S90马尔文纳米粒径仪，英国马尔文公司；Rigaku UItima IVX射线衍射仪（XRD），日本理学公司；LC-20AT型高效液相色谱仪，日本岛津公司；F7000型荧光光谱仪，日本日立公司。

HepG2细胞购买于广州吉妮欧生物科技有限公司；四氯化锆，批号C11495248，质量分数＞98%，上海麦克林生化科 技有限公司；对苯二甲酸、三氯化铁，分析纯，天津福晨化学试剂有限公司；N, N - 二甲基甲酰胺（DMF），冰醋酸、盐酸、磷酸、六水和硝酸锌，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；苯甲酸、二甲基咪唑，分析纯，天津光复科技发展有限公司；雷公藤红素，批号YRL0094201022，质量分数＞98%，宝鸡翊瑞生物科技有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青链霉素混合液、CCK8染色液，北京索莱宝科技有限公司；甲醇，色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；水为娃哈哈纯净水。

2方法与结果

2.1UIO-66制备工艺考察

2.1.1溶剂热法合成UIO-66 分别精密称定适量四氯化锆和对苯二甲酸，加入一定体积DMF充分溶解，加适量调节剂。将反应液转移至50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜内，在干燥箱内升温至120 ℃，恒温反应，反应结束后取出产物。12 000 r/min离心（离心半径75 mm）5 min，收集，沉淀分别依次用DMF和甲醇洗涤3次，置于真空干燥箱内室温干燥24 h。

2.1.2调节剂种类单因素考察比较不同种类调节剂乙酸、盐酸与苯甲酸对UIO-66的影响，其余制备条件一致。使用纳米粒径仪分别测定其粒径分布和多分散指数（polydispersity index，PDI）。表2结果表明，使用苯甲酸作为调节剂时，粒径较小且PDI值小于0.3，表明粒子分布较均匀。

2.1.3UIO-66 制备正交试验考察以粒径大小为指标，苯甲酸作为调节剂，采用3因素3水平正交实验设计，考察投料比（A）、溶剂量（B）、反应时间（C）对UIO-66粒径大小的影响。正交试验的因素水平、实验设计与结果以及直观分析见表3，方差分析见表4。

方差分析结果表明，3因素各水平无显著性差异。由直观分析可知，各因素对实验结果的影响依次为A＞B＞C，表明投料比对粒径影响较大。因素水平分析（K值分析）A为K3＞K2＞K1，A 1 粒径最小，即投料比四氯化锆-对苯二甲酸为1∶1；B为K2＞K1＞K3，B 3 粒径最小，即溶剂量60 mL；C为K1＞K3＞K2，C 2 粒径最小，即反应时间24 h。故UIO-66合成素最佳条件为A 1 B 3 C 2 ，即投料比1∶1，溶剂60 mL，反应24 h，此时制得UIO-66粒径最小。对A 1 B 3 C 2 进行3批验证，结果见表5。

3批验证结果表明，UIO-66合成工艺稳定可行，平均粒径为172.3 nm，分散性良好。

2.2 ZIF-8 制备工艺考察

2.2.1室温搅拌法合成ZIF-8 精密称取2-甲基咪唑溶解于一定体积溶剂中，精密称取六水硝酸锌溶解于少量溶剂中。在室温搅拌下，将六水硝酸锌溶液逐滴滴加至2-甲基咪唑溶液中，密闭搅拌一段时间，ZIF-8纳米粒自发形成，得到白色混悬液。12 000 r/min离心（离心半径75 mm）5 min，得到白色沉淀，甲醇洗涤3次，室温下真空干燥。

2.2.2溶剂种类比较ZIF-8 合成常用溶剂有水、甲醇、氨水及DMF，其余条件保持一致，比较分别使用4种溶剂制备ZIF-8粒径差异，结果见表6。水为溶剂合成ZIF-8粒径在200 nm左右，甲醇为溶剂合成ZIF-8粒径在600 nm左右，PDI均较低，分散均匀。12%氨水为溶剂合成ZIF-8粒径在250 nm左右，PDI较高，而DMF为溶剂室温下无明显产物出现，推测可能因为DMF常用于溶剂热法合成ZIF-8，室温合成法不适用。经比较，初步选择水作为合成溶剂制备ZIF-8。

2.2.3 ZIF-8合成正交试验考察以粒径大小为指标，水为合成溶剂，采用3因素3水平正交试验设计，考察投料比（A）、溶剂量（B）、反应时间（C）对ZIF-8粒径大小的影响。因素水平表、实验设计与结果以及直观分析见表7，方差分析见表8。

方差分析结果表明，A因素投料比与B因素溶剂量有显著性差异，C因素反应时间无统计学差异；由直观分析表可知，ZIF-8合成最优工艺为A 3 B 1 C 2 ，即投料比1∶50，溶剂10 mL，反应30 min。对A 3 B 1 C 2 进行3批验证，结果见表9。

3批验证结果表明，ZIF-8合成工艺稳定可行，粒径均在154 nm左右，分散性良好。

2.3 MIL-101 （Fe）合成正交试验考察

2.3.1溶剂热法合成MIL-101（Fe）分别精密称适量三氯化铁和对苯二甲酸，加入一定体积DMF充分溶解，加适量调节剂。将反应液转移至50 mL聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜内，在干燥箱内升温至110 ℃，恒温反应，反应结束后取出产物。12 000 r/min离心（离心半径75 mm）5 min收集，沉淀分别依次用DMF和甲醇洗涤3次，置于真空干燥箱内室温干燥24 h。

2.3.2MIL-101 （Fe）合成正交试验以粒径大小为指标，采用3因素3水平正交试验设计，考察投料比（A）、溶剂量（B）、反应时间（C）对MIL-101（Fe）粒径大小的影响。因素水平表、实验设计与结果以及直观分析见表10，方差分析见表11。

方差分析结果表明， 3因素均无显著性差异；由直观分析表可知，MIL-101（Fe）合成最优工艺为A 1 B 1 C 2 ，即投料比1∶1，溶剂10 mL，反应24 h。对A 1 B 1 C 2 进行3批验证，结果见表12。

3 批MIL-101（Fe）粒径均在550 nm左右，工艺较稳定。但粒子PDI均较大，分布不均匀。

2.43种MOFs粒子的表征

使用SEM和XRD分别对上述合成的3种MOFs粒子的形貌大小和晶体特征进行表征。

2.4.1SEM 取粉末样品各微量，甲醇超声分散后，滴1滴于空白玻片表面，室温挥干溶剂，在样品表面喷金2.5 min后，进行SEM观察，记录SEM图谱，观察晶体形貌大小。3种材料的SEM形貌如图1所示。UIO-66粒子呈类球形多面体形状，粒子大小均匀，形状规则；ZIF-8呈六面体形状，分散均匀，粒径较小；MIL-101（Fe）呈八面体形，形状规则，但粒子大小有差异，均匀性较差。

2.4.2XRD 取样品粉末各10 mg左右，在Cu-Kα（λ＝1.541 nm），高压40 kV，管流40 mA，扫描速度2°/min的条件下进行X射线衍射，得到衍射图谱（图2），测定样品的结晶度和纯度。UIO-66在2 θ 7.54 °、8.70°、25.90°、30.90°等处的衍射峰与文献报道一致[20]，且无其他材料衍射峰出现。ZIF-8衍射峰在2 θ 7.50 °、10.54°、12.90°、16.62°及18.20°，均符合文献已报道的ZIF-8衍射峰[21]。MIL-101（Fe）在2 θ 5.44 °、8.70°、9.30°、10.52°及16.68°处均出现明显的吸收峰，与已报道的MIL-101型的标准XRD特征峰一致[22]。

综合上述合成及表征结果，ZIF-8制备简便，粒径小，分布均匀，工艺稳定，较符合药物载体要求选择ZIF-8进行后续载药实验。

2.5 ZIF-8 装载雷公藤红素制备纳米粒（ZIF-8@ Cel）的性能研究

2.5.1ZIF-8 装载雷公藤红素工艺采用吸附法进行载药。将适量ZIF-8粉末置于雷公藤红素甲醇溶液中，室温密闭搅拌一定时间，12 000 r/min离心（离心半径75 mm）5 min，甲醇多次洗涤，室温下真空干燥，即得ZIF-8@Cel载药纳米粒。

2.5.2载药量测定

（1）雷公藤红素色谱条件：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse plus C 18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水水溶液（80∶20），等度洗脱；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长244 nm；进样量10 μL。

（2）对照品溶液的制备：精密称取雷公藤红素5 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为储备液。精确量取储备液2 mL于5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得含雷公藤红素0.2 mg/mL的对照品溶液。

（3）供试品溶液的制备：取ZIF-8@Cel约5 mg，精密称定，加1 mL冰醋酸，加适量甲醇超声处理（功率150 W、频率40 kHz）20 min，定容至10 mL量瓶中，摇匀，即得。

（4）阴性供试品溶液的制备：取空白材料约5 mg，精密称定，按照“2.5.2（2）”项方法制成阴性供试品溶液。

（5）专属性考察：分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各1 mL，经微孔滤膜滤过后，按照“2.5.2（1）”项下色谱条件，进高效液相检测，色谱图见图3。

（6）线性关系考察：精密称取雷公藤红素对照品5.0 mg置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为0.5 mg/mL的对照品母液。精密吸取母液适量，依次用甲醇稀释，得到质量浓度分别为0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005 mg/mL系列对照品溶液。按“2.5.2（1）”项下方法检测，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线并进行线性回归，得雷公藤红素的回归方程为Y＝12 125 696.90 X ＋14 234.01，R2＝1.000 0， 表明雷公藤红素在0.005～0.5 mg/mL线性关系良好。

（7）检测限与定量限：精确吸取“2.5.2（2）”项中对照品溶液，甲醇稀释，按照“2.5.2（1）”项色谱条件进行测定。样品峰高为仪器噪声高度3倍时的样品质量浓度即为样品的检出限，样品峰高为仪器噪声高度10倍时的样品质量浓度即为样品的定量限。结果显示，雷公藤红素的检测限为0.06 μg/mL，定量限为0.20 μg/mL。

（8）精密度试验：精密吸取质量浓度为0.2 mg/mL的雷公藤红素对照品溶液1 mL，按照“2.5.2（1）”项下色谱条件每天连续进样6次，连续进样3 d，记录峰面积，计算RSD值。结果日内精密度RSD为1.62%，日间精密度RSD为0.32%，表明其精密度良好。

（9）稳定性试验：精密移取ZIF-8@Cel供试品溶液1 mL，按照“2.5.2（1）”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，记录峰面积，计算RSD值，测得峰面积的RSD值为0.37%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

（10）重复性试验：重复制备6份ZIF-8@Cel供试品溶液，分别精密吸取上述供试品溶液各1 mL，按照“2.5.2（1）”项下色谱条件进样测定。结果ZIF-8@Cel样品中雷公藤红素的平均载药量为23.36%，其RSD值为1.15%，表明测定方法的重复性良好。

（11）加样回收率试验：精密称定ZIF-8@Cel样品2.5 mg，加入0.5 mg/mL对照品溶液1 mL，按照“2.5.2（3）”项下方法制备加样回收供试品溶液6份，测得加样回收率为97.77%，RSD小于5%，表明该方法回收率符合要求。

2.5.3ZIF-8@CEL 载药工艺单因素考察

（1）ZIF-8与雷公藤红素质量比考察：根据文献调研及预实验结果，设置ZIF-8与雷公藤红素质量比分别为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，药液质量浓度5 mg/mL，载药时间24 h，比较载药粒子粒径大小及载药量。结果（表13）表明，随着ZIF-8比例的增大，粒径呈减小趋势，变化幅度逐渐减小，比例为2∶1与3∶1粒径接近；载药量随着ZIF-8比例的增大而减小。综合粒径与载药量结果，选择ZIF-8与CEL比例2∶1进行后续实验。

（2）载药时间考察：载药时间的长短也对载药行为影响较大。暂定ZIF-8与CEL比例2∶1，药液质量浓度5 mg/mL，设置载药时间24、12、6 h进行考察。结果（表14）表明，时间越短粒子粒径越小，载药量越低，最终确定载药时间24 h。

（3）药液质量浓度考察：固定ZIF-8与CEL比例2∶1，载药时间24 h，比较药液质量浓度1、2、5、10、20 mg/mL的影响。结果（表15）表明，药物质量浓度为1 mg/mL时，粒径相对较小，同时载药量较高。

综合上述单因素结果，确定最佳载药工艺为ZIF-8与CEL质量比2∶1，载药时间24 h，药物质量浓度为1 mg/mL。进行3批最佳工艺验证，结果ZIF-8@CEL的平均粒径为（164.9±8.0）nm，PDI为0.297±0.029，载药量为（23.47±0.26）%，工艺稳定可行。

2.6细胞水平药效评价

HepG2细胞在含有10%胎牛血清和抗生素（100 µg/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）的DMEM高糖培养基中，在37 ℃、5% CO 2 下培养2～3 d。

在比较游离CEL和ZIF-8@CEL的细胞毒性作用之前，采用CCK-8法检测空白ZIF-8对HepG2细胞的体外细胞毒性。当细胞覆盖培养瓶底部的80%以上面积时，用胰蛋白酶消化收集细胞，并在新鲜培养基中重悬。细胞接种于96孔板，接种密度为100 μL/孔，接种数量为6000个/孔，培养过夜。然后用不同质量浓度的ZIF-8处理细胞24 h，弃上清液，每孔加入含10% CCK-8的100 μL培养基溶液，37 ℃避光孵育3 h。用酶标仪测定了在450 nm波长处的吸光度（A）值。根据表16，不同质量浓度的ZIF-8（0、10、20、30、40 μg/mL）孵育24 h后，细胞存活率无显著降低，说明ZIF-8在实验剂量下是无毒的。接着，CCK-8法比较了游离雷公藤红素和ZIF- 8@CEL对HepG2细胞的毒性。结果（表17）显示随着质量浓度升高，细胞存活率逐渐降低，具有明显质量浓度相关性。雷公藤红素的半数致死浓度（half-inhibitory concentration，IC 50 ）值为3.821 μg/mL，ZIF-8@CEL的IC 50 值为3.289 μg/mL（以雷公藤红素计）。含相同质量浓度雷公藤红素条件下，ZIF-8@CEL对HepG2细胞抑制效果更强，IC 50 值更小。

3讨论

MOFs结合了有机材料的可降解性及无机材料的高载药量的优势。其是由金属配位键、范德华力等作用力结合，其相对较弱的结合力会在体内被逐渐解离，变为小分子有机物及金属离子，小分子可直接被代谢，金属离子为体内存在的锌、铁等离子，可被吸收代谢，具有良好的安全性[23]。Baati等[24]制备了MIL88B、MIL88A及MIL100等多种铁基MOFs，并静脉注射到大鼠体内，发现其在体内会被肝脏和脾脏分解成铁离子和有机配体，并通过尿液和粪便排除，基本不存在代谢毒性。

本实验选择的3类MOFs分别属于UIOs系列、ZIFs系列与MILs系列。文献研究表明，这3类MOFs在生物医药领域的应用较多。UIO-66、ZIF-8与MIL-101（Fe）分别为3类MOFs中的代表，其金属中心依次为四价锆、二价锌及三价铁，包括了不同金属类型及价位，且3类材料具有不同的晶体结构，具有良好的代表性。目前，这3种MOFs作为药物载体的研究受到较多关注[25-26]。Haddad等[27]使用UIO-66负载抗肿瘤药物二氯乙酸，同时修饰了定位于线粒体的三苯基膦，具有良好的抗肿瘤效果和靶向性。Zhang等[28]使用ZIF-8负载抗肿瘤前药，进一步使用透明质酸功能化修饰，制备的纳米粒子具有良好的抗肿瘤效果。Cai等[29]将叶酸和5-羧酸荧光素用于修饰MIL-101（Fe）以构建功能化纳米平台，同时递送抗肿瘤药物雷公藤甲素，具有优异的荧光成像和协同靶向抗癌活性。本实验通过单因素考察结合正交试验分别对3类MOFs的合成工艺进行了优化，得到最佳制备工艺。经比较，ZIF-8粒径在154 nm左右，形状规则，晶型良好，分布均匀，适宜作为药物载体用于后续实验。

对于CEL的包载，常用方法有“一步法”与吸附法。“一步法”为药物与合成原料同时加入，在材料合成的同时，将药物分子包裹在材料孔隙内；吸附法为先合成空白材料，再将材料置于一定质量浓度药液中密闭搅拌一定时间，依靠材料吸附性进行药物装载。前期预试验发现，“一步法”制备的载药粒子载药量均较低，增加药物浓度以提高载药量的同时，粒径也急剧增大，载药量5%左右时粒径接近900 nm。经分析可能是由于雷公藤红素中含有羧基基团，其在二甲基咪唑形成的碱性溶液里与金属离子配位结合产生络合物，导致形成的ZIF-8金属中心数量少，粒子粒径大，同时载药量较低。因此最终采用吸附法进行载药，通过单因素试验，考察影响吸附法载药的3个因素载体药物比、载药时间与药物浓度，最终确定载药工艺为ZIF-8与雷公藤红素比例2∶1，载药时间24 h，药物质量浓度为1 mg/mL，得到ZIF-8@CEL粒径为165 nm左右，分散均匀，载药量约23%，工艺稳定可行。

最后，CCK-8细胞毒性试验评价了ZIF-8、CEL及ZIF-8@CEL对HepG2细胞的抑制作用，结果表明ZIF-8在实验剂量下安全性良好，ZIF-8@CEL相较于雷公藤红素抑制效果更强，IC 50 值更小。后续细胞毒性机制及体内抗肿瘤试验将进一步验证纳米载体的优势。